Methodenseminar

1. Methodenseminar Immunhistologie Yvonne Linde AG Dragun Nephrologisches Forschungslabor

2. Immunhistologie Eine zentrale Methode der histopathologischen Diagnostik und Forschung Immunhistochemische Techniken werden angewandt, um antigene Komponenten in Zellen und Gewebsschnitten im mikroskopischen Bild nachzuweisen

3. Programm • Allgemeine Grundlagen der Immunhistologie • Immunhistochemische Färbemethoden • Gewebepräparation Paraffingewebe - Fixierung - Paraffineinbettung Kryostatpräparation • Ablauf des IH-Protokolls • Fehlermöglichkeiten

4. Grundlagen der Immunhistologie Was wird nachgewiesen? • Differenzierungsmarker • Funktionsproteine • Therapeutische Zielproteine • Proteine von Erregern Nachweis von Proteinen, Polysacchariden und anderen Strukturen, gegen die Antikörper gebildet werden können

5. Grundlagen der Immunhistologie Prinzip: Antigen-Antikörper Reaktion Spezifische Erkennung von Antigenen durch Antikörper und die anschließende Verstärkung des Signals durch weitere Brückenantikörper, um schließlich das Antigen mittels einer Farbreaktion sichtbar zu machen Antigene: Substanzen, die im Organismus die Bildung von Antikörpern induzieren können Antikörper: Proteine, die in der Gammaglobulinfraktion des Blutserums enthaltensind

6. Grundlagen der Immunhistologie • Antikörper gehören meist zur Immunglobulinklasse IgG • Immunglobuline sind aus jeweils zwei • identischen schweren und zwei leichten • Polypeptidketten aufgebaut • schweren Ketten determinieren die • Immunglobulinsubklasse (IgG, IgM, IgA, IgE, • IgD) • jede Polypeptidkette ist aus einer variablen (V-) • und einer konstanten (C-) Region • die variablen Regionen sind für die Bindung des • Antigens verantwortlich • Fc-Teil ist die Bindungsstelle des • Sekundärantikörpers

7. Grundlagen der Immunhistologie • Polyklonale Antikörper stammen von einem Plasmazellpool unterschiedlicher Klonalität und sind gegen unterschiedliche Epitope des gleichen Antigens gerichtet Vorteil: kann auch bei veränderten Epitopen verwendet werden Nachteil: Kreuzreaktion • Monoklonale Antikörper stammen aus einem einzigen Plasmazellklon und sind alle gegen das gleiche Epitop eines Antigens gerichtet Vorteil: hohe Spezifität Nachteil: teilweise zu enge Spezifität, geringe Stabilität

8. Immunhistochemische Färbemethoden Der Antigennachweis erfolgt mit spezifischen Antikörpern, die mit Fluoreszenzfarbstoffen, Enzymen, partikulärem Material (z.B. Goldpartikel) oder mit radioaktiven Isotopen markiert sind Man unterscheidet: • Direkte Nachweismethode • Indirekte Nachweismethode 2-Schritt Methode 3-Schritt Methode

9. Immunhistochemische Färbemethoden • Direkte Nachweismethode • ein markierter Antikörper bindet mit dem Antigen • bei einer Enzymmarkierung wird das Antigen durch eine anschließende • Substrat-Chromogen-Reaktion nachgewiesen • bei einer Fluoreszensmarkierung erfolgt der Nachweis durch Anregung mit • Licht in einer bestimmten Wellenlänge Ist eine hochspezifische Nachweismethode, besitzt aber eine geringe Sensitivität

10. Immunhistochemische Färbemethoden Indirekte Nachweismethode 2-Schrittemethode • Ein erster unmarkierter Antikörper (Primärantikörper) bindet mit dem zu suchenden Antigen • Anschließend wird dieser über einen zweiten, markierten Antikörper (Sekundärantikörper) gebunden, der an das FC-Fragment des Primärantikörpers bindet • Dieser Sekundärantikörper ist je nach Makierungsart (Fluoresenz- oder Enzymmarkierung) für die Nachweisreaktion verantwortlich Sekundärantikörper markiert Primärantikörper Antigen Zelle

11. Immunhistochemische Färbemethoden 3-Schritt Methode • hier erfolgt zusätzlich noch eine Bindung mit einem Enzym-gekoppelten AK der gegen den Sekundärantikörper gerichtet ist • sichtbarer Nachweis ebenfalls je nach Markierung • durch die große Anzahl Enzymmoleküle wird die Empfindlichkeit gesteigert • höhere Sensitivität

12. Immunhistochemische Färbemethoden Methode der löslichen Enzym-Immunkomplexe Nutzen die Affinität von Antikörper gegenüber ihrem Antigen durch Einsatz stabiler Immunkomplexe. Dies führt zur Signalverstärkung und damit zur Erhöhung der Sensitivität durch die größere Anzahl an Enzymmolekülen • APAAP-Methode Immunkomplexe bestehen aus alkalischer Phosphatase und anti-Alkalischer Phosphatase • PAP-Methode Immunkomplexe bestehen aus Peroxidase und Anti-Peroxidase

13. Immunhistochemische Färbemethoden Avidin-Biotin-Methoden • hier wird die starke Affinität von Avidin oder Streptavidin zu Biotin genutzt • Avidin ist ein aus Hühnereiweiß isolierbares Glycoprotein mit 4 Bindungsstellen für Biotin • ist eine der höchsten bekannten biologische Bindekonstanten • haben die höchste Sensitivität

14. Lokalisation der Ag-AK-Reaktion Bei der Fluoreszenzmarkierung erfolgt die Sichtbarmachung durch Anregung durch Licht einer bestimmten Wellenlänge • hohe Ortsauflösung (Signal am AK selbst) Bei der Enzymmarkierung erfolgt eine enzymatische Umsetzung des Chromogens • geringere Ortsauflösung ( Signal um den AK herum) Chromogen: Farblose, lösliche Substanzen, die durch enzymatische Umsetzung wie Oxidation oder Bindung an Salze zu unlöslichen und farbigen Produkten führen Reaktionsprodukte präzipitieren am Ort ihrer Entstehung und markieren so die Lage der gesuchten Antigene im Gewebe

15. Chromogene • AEC (3-Amino-9-ethylcarbazol) bildet unter Oxidation ein rosarotes Farbprodukt • DAB (3,3-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid) bildet nach Oxidation ein braunes Farbprodukt • Fast-Red • BDHC Peroxidase Substrate Solution Blue • Histogreen • New Fuchsin Alkaline Phosphatase Substrate

16. Immunhistochemische Färbemethoden Ergebnisse der Avidin-Biotin Methode PCNA

17. Immunhistochemische Färbemethoden Ergebnisse der APAAP-Färbung ED1

18. Immunhistochemische Färbemethoden weitere Methoden • Immunfluoreszenzfärbung • Immunfluerszenzdoppelfärbung • Doppelfärbung auf Basis der Polymere Technik • Doppelfärbung auf der Basis der ABC-Methode (über zwei verschiedene Enzymkomplexe)

19. Immunfluoreszenzfärbung Vimentin-AK mit FITC gelabelt

20. Immunfluoreszenzfärbung Catenin-AK mit Cy3 gelabelt

21. Immunfluoreszenzdoppelfärbung Kernfärbung mittels DAPI

22. ImmunfluoreszenzdoppelfärbungErgebnis der Vimentin-Catenin-Doppelfärbung

23. Gewebepräparation Gewebe nach Organentnahme mit 4% gepufferten Formalin fixieren Formalin vernetzt die Proteine miteinander und immobilisiert lösliche Antigene Proteinvernetzung kann aber auch zur Maskierung oder Zerstörung antigener Strukturen führen • kleine Gewebsstücke fixieren • 24 h bei Raumtemperatur oder 48 h im Kühlschrank • gleichmäßige Durchtränkung ermöglichen • Gewebe muss durchfixiert sein • Anschließend 70% Ethanol, kurze Lagerung möglich

24. Gewebepräparation Paraffineinbettung • Fixierte Gewebeproben nach der Entwässerung in Paraffin einbetten Einbettautomat 60 °C warmes Paraffin • Paraffin durchtränktes Gewebe in Histokassetten ausgießen • Nach der Abkühlung ist ein schneidbarer Gewebeblock entstanden • Gewebe schneiden, möglichst 2 µm dünne Schnitte • Für die Immunhistologie silanisierte Objektträger verwenden Beschichtung mit 3-Aminopropyltriethylsilan (APES) oder Super-Frost-Plus Objektträger verwenden

25. Gewebepräparation Kryostatpräparation • Proben werden nativ oder nach Fixierung in flüssigem Stickstoff schockgefroren • Gewebe am Kryostaten schneiden 5-10 µm dünne Schnitte Gewebe darf nicht antauen Acetonfixierung Vorteil: keine Epitopdenaturierung Nachteil: Erhaltung der Gewebestrukturen Bildung von Eiskristallen

26. Antigendemaskierung Maskierung Die Fixierung der Gewebeproben kann zu einer starken Maskierung von antigenen Bindungsstellen führen • Ausgeprägte Aldehydvernetzungen von Proteinen, die antigene Bindungsstellen abdecken aber nicht zerstören • Durch verschiedene Antigendemaskierungs-Methoden, können maskierte Antigene zumindest teilweise wieder freigelegt werden

27. Antigendemaskierung Antigendemaskierung erfolgt je nach Antikörper mit unterschiedlichen Methoden • Proteolytischer Verdau mit Trypsin, Pronase o.ä. • Kochen der Schnitte im Dampfdrucktopf, Dampfgarer, Autoclaven oder in der Mikrowelle mittels Citratpuffer oder kommerzielle Antigen-Retrievel-Solution Dampfdrucktopf: Citratpuffer pH=6,0 aufkochen Schnitte in den kochenden Puffer geben wenn Dampfdruck entsteht die Schnitte 10 min kochen

28. Ablauf der Immunhistologie nach der ABC-Methode • Entparaffinierung • Antigendemaskierung • Blocken unspezifischer Bindung • Inkubation Primärantikörper 60 min • anschließend waschen • Inkubation Sekundärantikörper 30 min • anschließend waschen • Inkubation mit Streptavidin 30 min • Entwicklung mittels Chromogen • Gegenfärbung mit Hämalaun

29. Probleme des immunhistologischen Nachweises • Hintergrundreaktivität elektrostatische und hydrophobe Interaktionen →blockierende Proteinlösungen verwenden endogeneEnzymaktivität → endogene Enzyme blockieren mittels Blocklösungen Kreuzreaktivität → unspezifische Bindungsstellen mit Antiseren aus der gleichen Spezies präinkubieren

30. Fehlermöglichkeiten • Bedingte Probleme durch die Gewebepräparation - Fixierungszeiten beachten !!! - auf gute Schnittqualität achten (Wahl der Messer) • Probleme bei der AG-Demaskierung - pH-Wert der Demaskierungslösungen • Antikörper-Etablierung - Verdünnungsreihen - auf die Spezies des Antikörpers achten - auf die IgG-Klasse des Antikörpers achten - Lagerung und Stabilität der Antikörper • Trocknungsartefakte • Waschen - pH Wert der Waschlösungen

31. Vielen Dank !!!