1 / 65

H05IDB

H05IDB. Marcel Lombaerts G3.052. IDB HC 9-12: Detectie en isolatie van nucleïne zuren. Principles and Techniques of..... .(Wilson and Walker) 7th edition H5.1, 5.2 , 5.6 t/m 5.7.2, 5.8 en 5.10 t/m 5.10.4 H10.2.1, 10.4.1 en 10.4.4 Biology (Campbell), 9th edition

ahanu
Download Presentation

H05IDB

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. H05IDB Marcel Lombaerts G3.052

  2. IDB HC 9-12: Detectie en isolatie van nucleïne zuren • PrinciplesandTechniques of......(Wilson and Walker) 7th edition • H5.1, 5.2, 5.6 t/m 5.7.2, 5.8 en 5.10 t/m 5.10.4 • H10.2.1, 10.4.1 en 10.4.4 • Biology (Campbell), 9th edition • H16.1 en H20.1 en 20.2 • Biochemistry (Campbell andFarrel), 7th edition • H13.1, 13.2, 13.6 en 13.7

  3. IDB HC 9-10: basis (+) nucleïnezuren • Structuur van DNA and RNA • DNA sequenties bij NCBI • Zuiveren van DNA, RNA and mRNA • Restrictie enzymen • Gel electrophoresis

  4. I. Structuur van nucleotiden DNA en RNA zijn polymeren. Bouwstenen zijn nucleotiden.

  5. 5 4 1 3 2 5 5 1 1 4 4 3 3 2 2 Suikers

  6. U U U 5 5 1 1 4 4 3 3 2 2 Stikstofbasen

  7. 5’ en 3’ 5 3 5 H2O 3 RNA!

  8. U U 5 5 1 1 4 4 3 3 2 2 Ketens

  9. G C T A C G T A Baseparing G C A T

  10. Baseparing G C A T

  11. Opdracht

  12. RNA is een polymeer van rNTPs

  13. RNA is instabieler dan DNA • RNA heeft OH groepen aan de C2 (2’), deze maken het molecuul gevoeliger voor hydrolyse • DNA heeft geen 2'-OH is is daardoor stabieler • Dat is logisch...

  14. Verschillende typen RNA moleculen • Messenger RNA (mRNA) • mRNA bevat de code van de temakeneiwitten • Complementairaan de coderende DNA sequentie • Ribosomal RNA (rRNA) • Vormen de ribosomen (samen met enkeleeiwitten) • 3 typenin prokaryoten(5S, 16S, 23S) • 4 typenin eukaryoten(5S, 5.8S, 18S, 25-28S) • Transfer RNA (tRNA) • Transporteerdaminozurennaar de plek van eiwitsynthese (small RNA: snRNA, snoRNA, miRNA, siRNA, piRNA)

  15. RNA Er zijn verschillende RNA’s • mRNA: worden vertaald naar eiwitten • rRNA: vormen de ribosomen die nodig zijn voor translatie • tRNA: nodig voor het maken van eiwitten (gekoppeld aan aminozuren)

  16. Voorbeeld tRNA • RNA’s kunnen een intramoleculaire baseparing hebben (voornamelijk tRNA en rRNA)

  17.  Voorbeeld 16S rRNA

  18. Lokatie in de cel • DNA: constante factor (“genetic makeup”) • RNA: verschillen per celtype, fase, omgeving enz. (“information flow”)

  19. RNA: • 2’OH group (ribose) • Uracil binds Adenine (A,U,C,G) • Multiple types and roles • Often permanently modified via splicing • Usually single-stranded • Intramolecular binding DNA: • 2’H (deoxyribose) • Thymine binds Adenine(A,T,C,G) • One biological form • Permanently modifications are rare (mutation) • Double stranded • Double helix structure Verschillen tussen RNA en DNA

  20. II. DNA sequenties: NCBI site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

  21. NCBI site

  22. III. Isolatie en zuivering van nucleïnezuren • Welk nucleïnezuur heb je nodig? (ssDNA, dsDNA, RNA, mRNA) • Welk organisme? (menselijke cellen, lagere eukaryoten, planten, prokaryoten, virussen, enz.) • Uitgangs materiaal? (heel orgaan, cel culture, bloed enz.) • Wat ga je ermee doen? (PCR, cloneren, labellen, RT-PCR, cDNA synthesis, enz.)

  23. Methode (algemeen) isolatie nucleïnezuren • Cellen openbreken • Nucleïnezuren scheiden van de rest (eiwitten en membranen) • Nucleïnezuren isoleren

  24. DNA isolatie fenol chloroform (1) • Homogeniseren weefsel, lysis, proteinase K • Eerst fenol en daarna fenol : chloroform : isoamylalcohol (25:24:1) • Centrifugatie

  25. DNA isolatie fenol chloroform (2) Precipitatie (neerslaan) - isopropanol, (soms KAc en) ethanol (eindconcentratie 70%) of ammoniumacetaat - incuberen: -20 °C tot 4 oC Afdraaien Wassen met ethanol 70-75% bij KT/ 4 oC

  26. DNA isolatie fenol chloroform (3) Drogen - “aan de lucht” - bij 37, 50, 60 oC • “speedvac” DNA oplossen in 10 mM Tris 1mM EDTA (T10E1) pH 7,4 - 7,6 Oplossen RNA in RNase vrij H2O (soms TE)

  27. Waarom? • Cellen wassen? • Wat zit er in lysisbuffer? • ProtK stap? • Fenol? • Wassen met 70% EtOH? • Waarom drogen? • TRIS in de buffer? • EDTA in DNA buffers? • Vaak geen EDTA in RNA oplosbuffers?

  28. Andere methoden… • fenol/chloroform extractie en ethanol precipitatie • silica membraan kolommen • anion exchange resins (ionenwisselaars) • magnetische beads

  29. DNA isolatie: silica membraan - Homogeniseren (lyseren, met zout) - Centrifugeren • Elueren (laag- zout) Roche, Fermentas

  30. Opdracht Een analist gebruikt de silica membraan methode voor het isoleren van DNA uit cellen. Na het lyseren en het verwijderen van het celdebris brengt hij het sample met veel opgelost zout op de silica kolom. Vervolgens draait hij af en verwijdert de flow-thru. Hierna wast hij de kolom met water (flow-thru wordt weer verwijderd) waarna het DNA geëlueerd wordt met een laag zout buffer. Na meting op de NanoDrop blijkt dat er geen DNA aanwezig is in het sample. Leg uit wat de oorzaak hiervan is.

  31. Anion-exchange resin • Homogeniseren • lyseren, zonder zout • Centrifugeren • Elueren (pH en zout concentratie) Qiagen kits

  32. Elutie anionen wisselaar kolom

  33. Opdracht

  34. Magnetic particles/beads - Homogeniseren met balletjes (silica coated) • Magnetiseren • Wassen - Elueren (losmaken van de balletjes) EZ1 Biorobot, Qiagen Magnapure, Roche Kingfisher Cobas Ampliprep

  35. Overzicht

  36. http://learn.genetics.utah.edu

  37. RNA isolatie • Erg vergelijkbaar met DNA isolatie (phenol chloroform procedure) • In de cel zit veel meer RNA dan DNA • RNA isolatie: meestal totaal RNA (rRNA, mRNA, en in mindere mate tRNA) • mRNA (poly A+ RNA) ≈ 1-5% van het totale RNA

  38. mRNA isolatie • 1-5% van het totaal RNA in eukaryoten is mRNA • het merendeel is rRNA Oligo (dT)25 bead Poly (dT) bead • genexpressie onderzoek TTTTTTT

  39. Werken met RNA RNase!!!! • Bewaar RNA bij (-20°C of) -80°C, werk op ijs • Draag handschoenen • Gebruik DEPC-treated water om oplossingen te maken • Voeg eventueel RNase inhibitors toe • Gebruik RNase vrije epjes en puntjes • Andere materialen: hitte (180 ºC gedurende enkele uren), wassen met DEPC water, NaOH of H2O2 • Maak een aparte RNA ruimte? RNA lab

  40. DNA / RNA DNA / RNA hoeveelheid & kwaliteit

  41. DNA / RNA concentratie bepalen [DNA] of [RNA]: absorptie of emissie (fluorescentie) Licht (x nm golflengte) Absorptie x nm Licht (x nm golflengte) Emissie  fluorescentie y nm excitatie

  42. DNA / RNA concentratie bepalen (absorptie) I. Concentratie DNA & RNA met UV-VIS spectrofotometer (absorptie) Licht (x nm golflengte) Absorptie x nm

  43. DNA / RNA concentratie bepalen (absorptie) I. Concentratie DNA & RNA met UV-VIS spectrofotometer (absorptie) 1) Meet de A260 nm (OD260) A260=1 dan 50 g/ml DNA of 40 g/ml RNA concentratie DNA in g / ml = 50 * absorptie DNA bij 260 nm concentratie RNA in g / ml = 40 * absorptie RNA bij 260 nm 2) Meet bij 280 nm = eiwitten Bepaal de 260 / 280 ratio: DNA: A260/280=1,8 RNA: A260/280=2,0 (pH7,5) In de praktijk: tussen 1.6 en 2.0 liggen – (redelijk) eiwitvrij DNA / RNA

  44. Opdracht • 5 l van een DNA oplossing wordt doorgemeten in een eindvolume van 1 ml, de OD260 = 0,213. Cuvetlengte is 1 cm • Wat is de concentratie van deze DNA oplossing?

  45. DNA / RNA concentratie Nanodrop UV-VIS spectrofotometer Rekent zelf de concentratie en A260/280 verhouding uit

  46. DNA / RNA concentratie bepalen (fluorescentie) II. Concentratie DNA & RNA d.m.v. fluorescentie Licht (x nm golflengte) Emissie  fluorescentie y nm excitatie

  47. DNA / RNA concentratie Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen Picogreen toevoegen aan dsDNA  fluorescentie

  48. DNA / RNA concentratie Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen 1 Maak een ijklijn 2 Sample waarvan je de concentratie wilt weten 375 ng / ml

  49. DNA / RNA concentratie Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen

More Related