1 / 22

Základné metódy práce s ľudskou DNA

Základné metódy práce s ľudskou DNA. Izolácia DNA. DNA - v jadre bunky - v komplexe s bielkovinami Postup: lýza bunkových membrán (SDS) štiepenie proteínov (proteináza K) odstránenie proteínov (fenol/chloroform) vyzrážanie DNA (etanol). Izolácia DNA kitom. Postup:

adrian-hernandez
Download Presentation

Základné metódy práce s ľudskou DNA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Základné metódy práce s ľudskou DNA Katedra molekulárnej biológie

  2. Izolácia DNA • DNA - v jadre bunky - v komplexe s bielkovinami Postup: • lýza bunkových membrán (SDS) • štiepenie proteínov (proteináza K) • odstránenie proteínov (fenol/chloroform) • vyzrážanie DNA (etanol)

  3. Izolácia DNA kitom Postup: • lýza bunkových membrán a štiepenie proteínov • naviazanie DNA na kolónu • premytie kolóny • elúcia DNA • precipitácia DNA

  4. Určovanie kvantity a kvality DNA • Spektrofotometricky • kvantita – OD pri 260 nm (1 OD ~ koncentrácia 50 μg/ml) • kvalita – pomer OD pri 260/28nm (ideálne ~ 1,8) • Elektroforézou • kvantita – porovnaním so štandardom • kvalita – určenie degradácie DNA

  5. Elektroforéza DNA

  6. Separačné média pre analýzu DNA Polyakrylamid Separácia jednovláknovej a dvojvláknovej DNA rozdiel vo veľkosti fragmentov od 1 nt Agaróza separácia dvojvláknovej DNA rozdiel vo veľkosti fragmentov od 10nt

  7. Vizualizácia DNA v géli • EtBr, SYBR Green (agarózový gél, polyakrylamnidový gél) • interkalačné činidlo • dsDNA • UV lampa • AgNO3 (polyakrlylamidový gél) • ssDNA a dsDNA • denné svetlo • Fluorescenčné farbičky (genetický analyzátor) • kovalentná väzba farbičky na primer • ssDNA • laser a CCD kamera

  8. Štiepenie DNA restrikčnými endonukleázami • enzýmy súčasťou RM systému baktérií • názvy podľa pôvodu • 5´prečnievajúce konce, 3´prečnievajúce konce, tupé konce

  9. Elektroforéza DNA po štiepení RE

  10. Príprava rekombinantných DNA

  11. Hybridizácia DNA • komplementarita báz • Tm (GC content)

  12. Southernov blotting • genomická DNA • štiepenie RE • elektroforéza • oligonukleotidová sonda k unikátnej sekvencii

  13. FISH technológia • detekcia numerických a štrukturálnych chromozómových aberácií • fluorescenčne značené oligonukleotidové sondy • fluorescenčný mikroskop

  14. Microarray/ DNA chip • Hybridizácia fluorescenčne značenej, testovanej DNA s DNA sondou viazanou na detekčnom sklíčku

  15. DNA microarray a DNA chip • možnosti aplikácie technológií DNA microarray a DNA chip

  16. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) • Kary B. Mullis - 1993 Nobelova cena

  17. Princíp PCR

  18. Verifikácia PCR amplifikácie

  19. PCR odporúčané nastavenie • úvodná denaturácia DNA 94 – 95 ºC 2 – 5 min • cyklické opakovanie – 25 - 35 x denaturácia 94 – 95 ºC 30 – 40s hybridizácia T = Tm – 3 ºC polymerizácia 72ºC 45s (do 1 kb) • záverečná polymerizácia 72 ºC 7 min • Chladenie/inaktivácia reakcie 4 – 10 ºC • DNA • 50 – 500 ng • primery • 16 – 24 nt dlhé • Tm 48 – 65 ºC • GC content 40 – 60 % • 1 – 10 pmol/na reakciu • dNTP • 50 - 500 μM • MgCl2 • 1 – 5 mM • DNA polymeráza • 0,5 – 2,5 U

  20. Sekvenovanie (Sanger) 1

  21. Sekvenovanie (Cycle sequencing)

  22. Pyrosequencing

More Related