Tipos de HPLC

1. Tipos de HPLC Danica Olascoaga Sánchez Alan Velasco Muciño Arroyo Daniela Zarzosa Moreno

2. Intercambio Iónico • Es un método eficaz para la separación y determinación de iones. • Se basa en el uso de las resinas e intercambio iónico. • Se desarolló cuando se demostró que se podían resolver fácilmente mezclas de cationes o aniones mediante las columnas de HPLC rellenas con resinas de intercambio catiónico o aniónico.

3. Fundamento • En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las muestras que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel, siendo eluidas las restantes. • Para eluir las muestras retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico de la muestra de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a la muestra en la columna.

4. Rellenos/Resinas • Los procesos de intercambio iónico se basan en los equilibrios de intercambio entre los iones de una disolución y los iones del mismo signo que están en la superficie de un sólido de elevada masa molecular y esencialmente insoluble.

5. Tipos de Resinas • Resinas de partículas esféricas porosas, copolimerización del estireno y el divinilbenceno. • Relleno de partícula pelicular, sílice recubierto • Resinas basadas en carbohidratos.

6. Intercambio Catiónico • Los sitios activos más comunes en las resinas de intercambio catiónico son los grupos de ácido sulfónico un ácido fuerte y los grupos de ácido carboxílico un ácido débil.

7. Intercambio Catiónico • Cuando un intercambiador iónico de ácido sulfónico se pone en contacto con un disolvente acuoso que contiene cationes MX+ se establece un equilibrio de intercambio que puede describirse por:

8. Intercambiador Catiónico

9. Intercambiadores Aniónicos • Los intercambiadores aniónicos contienen grupos amino terciario o amino primario ; los primeros son bases fuertes y los últimos bases débiles.

10. Intercambiador Aniónico • De una forma semejante, un intercambiador de base fuerte interacciona con los aniones Ax- según la siguiente reacción.

11. Intercambiador Aniónico

12. Constante de Equilibrio • Se considera la reacción entre los iones de una sola carga B+, con una resina de ácido sulfónico.

13. Cuando la K tiene un valor alto, la fase sólida tiene una gran tendencia a retener los iones B+ y cuando K es pequeña sucede lo contrario.

14. Cromatografía de Ión Suprimido • Falta de un buen sistema de detección universal. Se solucionó con detectores de conductividad pero se requiere de una elevada concentración de electrolito. • La columna supresora del eluyente, está rellena con una segunda resina de intercambio iónico.

15. Un inconveniente de las columnas supresoras es la necesidad de regenerarlas periódicamente. • Recientemente se dispone de supresores de membrana que operan continuamente. Donde el eluyente y la disolución supresora fluyen en direcciones opuestas en ambos lados de las membranas permeables de intercambio iónico.

17. Cromatografía Exclusión de Iones

18. Tiene aplicaciones en la identificación y determinación de especies ácidas en distintas muestras. Las sales de los ácidos débiles se convierten en sus correspondientes ácidos en presencia de los protones del intercambiador. También se puede determinar por cromatografía de exclusión de iones las bases débiles y sus sales.

19. De Fase Ligada • Reemplazando el tipo común de unión de la fase estacionaria a su soporte, haciéndola perdurable por medio de una unión química covalente.

20. Factores que afectan la retención • Fuerza iónica • pH: Sólo para intercambiadores, aniónicos o catiónicos, débiles, ya que los fuertes están totalmente disociados. Para aquellos se cumple: • Modificadores Orgánicos

21. Aplicaciones • La cromatografía de intercambio iónico se ha aplicado a una gran variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos incluyendo fármacos y sus metobolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azúcares y preparaciones farmacéuticas.

24. Exclusión Molecular Es una técnica de purificación muy utilizada y debido a su sencillez y eficacia en la resolución de mezclas complejas de macromoléculas. Es muy utilizada para fines analíticos.

26. El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel hidratado. • El volumen de vacío (Vo), o el volumen de agua existente entre las esferas del gel (fuera de ellas). • El volumen ocupado por el agua en las esferas del gel (Vi), que se expresa como la diferencia entre los dos volúmenes anteriores: Vt-Vo-Vg

27. Principio • Las moléculas de muy pequeño tamaño penetran en el interior de las esferas que componen el gel y por lo que no son extraídas de la columna hasta que no ha pasado a través de ella un volumen de líquido igual a su volumen total (Vt)

28. Este tipo de cromatografía separa las sustancias en función de dichos pesos moleculares, obteniéndose primero las más pesada

29. Tipos de geles Los geles utilizados como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan hasta formar una red tridimensional. Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano (SEPHADEX), agarosa y poliacrilamida. Estos geles se identifican por una denominación de G-10 hasta G-200.

31. Factores que pueden alterar la separación • Longitud de la columna. • Flujo. Normalmente el flujo oscila entre 2 y 10 cm h-1. • El volumen de la muestra a cromatografía. Debe ser iguale o menor al 5% del volumen total. • Empaquetado del gel en la columna. L

32. Medición de la exclusión • Se expresan en forma de gráficas (cromatograma) donde se representa la cantidad de solutos en función del volumen de líquido extraído de la columna.

33. Volumen de elución (Ve): Es volumen de líquido necesario para extraer una determinada sustancia. El Ve de una sustancia varía entre Vt y Vo. • Coeficiente de distribución (Kd). Representa la fracción de volumen del interior de las esferas a la que accede cada sustancia dependiendo de su tamaño. Kd = Ve-Vo/Vt-Vo

34. Ventajas y Desventajas • Tiempos de separación cortos y muy bien definidos, • Bandas estrechas buena sensibilidad • No hay pérdida de muestra • No se desactiva la columna por la interacción del soluto con el relleno. • Sólo una cantidad limitada de bandas se puede acomodar porque la escala de tiempo del cromatograma es corta. • No sirve con isómeros.

35. Fase Normal • La cromatografía de fase normal utiliza una fase estacionaria polar(frecuentemente hidrofílica) y una fase móvil menos polar. • El componente menos polar se eluye primero,

36. Elección de fases • Fase móvil (no polar) • Fase estacionaria (polar)

37. Fase reversa

38. Fundamento: se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre • un solvente –polar • uncompuesto – apolar • faseestacionaria- apolar. • La elución se produce como un reparto de cada componente entre dos solventes no miscibles. • La fase solida lipofilica y el solvente que circula, es una cromatografía de reparto y no de adsorción • técnica proporciona retención y selectividad óptimas cuando las muestras tienen un carácter • predominantemente alifático o aromático.

39. Fundamento: • El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. • La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La

40. Modificadores: • La fuerza conductora en la unión de compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. • Es decir que la disminución de la energía libre de la entropía asociada con la minimización de la interfase compuesto-disolvente polar (efecto hidrofobico) • El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. (modifica el coeficiente de partición- provocando que el compuesto se mueva por la columna y eluya.)

41. Modificadores: • adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial(la entropía de la interfase compuesto-disolvente es controladapor la tensión superficial)-aumentar el tiempo de retención. • El pHpuede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por lo que se utiliza un tampón como el fosfato de sodio por controlar el valor del pH y neutralizar la carga (actúan como contraiones) o cualquiera resto de sílica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta • El tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al tamaño del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida.

42. Ejemplos: •  Un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. •  tampón-como el fosfato de sodio por controlar el valor del pH

43. columnas: • Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de sílica normales.  • formadas por sílica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso ( dañar el esqueleto de sílica) • Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso ( no deben estar expuestas un largo tiempo corroen el equipo)

44. Fase estacionaria: • Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la sílica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17 que se le ha injertado. • De este modo las partículas forman una fase lipófila que retiene las moléculas poco polares.

45. Fase móvil: • El tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al tamaño del compuesto. • Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida.

46. Ejemplos: Los eluyentes utilizados son de polaridad alta a media: • agua • Metanol • Acetonitrilo • Acetona • Etanol • MEK • Acetato de etilo • THF

47. Supresión iónica: • se utiliza para la separación de especies ionizables • se añade a la fase móvil un compuesto iónico que aporta un • contra­ión orgánico grande; la concentración de estos agentes está en un rango de 0.01 % a 0.03 %. • la molécula del soluto forma un par iónico con el contra­ión en la fase móvil y de esta manera aumenta la hidrofobicidad de la muestra • el contra­ión se retiene en la fase estacionaria que es • normalmente neutra y le proporciona una carga. Esta fase estacionaria cargada puede entonces formar complejos con los iones orgánicos de carga opuesto

48. Laretención aumenta conforme el pH maximiza la concentración de la forma iónica de los solutos. • Un pH bajo asegura que las bases fuertes estén en su forma iónica protonada y que los ácidos débiles presentes estén en su forma no iónica.

49. Casos en los que se ocupa: • Análisis de proteínas –TFA, acido orto fosfórico • Análisis de ácidos nucleicos – trietilamina

50. Aplicaciones analíticas: Separación de los siguientes grupos de biomoléculas: • Proteínas y péptidos de origen natural • Proteínas y péptidos recombinantes • Péptidos obtenidos por digestión enzimática • Péptidos sintetizados químicamente • Oligonucleótidos sintético La cuantificación en RPC se basa en la comparación del área del pico del compuesto problema con las de uno o más estándares