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Zellfraktionierung

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Zellfraktionierung. Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae. Durchführung. Anzucht der Zellen auf unterschiedlichen Nährmedien Ernten A ufschluss der Zellen: enzymatisch und mechanisch Isolierung + Reinigung der Fraktionen Mitochondrien Mikrosomen Proteinbestimmung nach Lowry

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Presentation Transcript
zellfraktionierung

Zellfraktionierung

Organellenpräparation aus Saccharomyces cerevisiae

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

durchf hrung
Durchführung

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

  • Anzucht der Zellen auf unterschiedlichen Nährmedien
  • Ernten
  • Aufschluss der Zellen: enzymatisch und mechanisch
  • Isolierung + Reinigung der Fraktionen
    • Mitochondrien
    • Mikrosomen
  • Proteinbestimmung nach Lowry
  • Markerenzymmessungen
    • NADPH-Cytochrom c-Reduktase (Mikrosomen)
    • Succinatdehydrogenase (Mitochondrien)
  • Quantitative Bestimmung der Cytochromen
reagentien
Reagentien

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

  • Puffer A (Dithiothreitol)
    • Di-Sulfidbrückenwerden dadurch aufgebrochen (Vorbereitung für Zymolyasezugabe)
  • Puffer B ( Sorbit) & Puffer C ( Mannit)
    • Damit der osmotische Druck stabil bleibt
  • Zymolyase
    • Enzym zum Abbau von Zellmembran
  • Phenylmethylsulfonylfluorid
    • Inhibiert proteolytische Abbaureaktionen
  • Triton X-100
    • Detergenz löst Membranlipide
  • Phenanzinmethosulfat
    • Mediator zur Wasserstoffübertragung, verstärkt die Reaktion
aktivit tsmessung
Aktivitätsmessung

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

  • Messung durch
    • Aktivitätsenzym, welches nur in spezifischen Organell einer Zelle eine Reaktion hervorruft
    • Immunologische Charakterisierung
    • Identifizierung von Zellfraktionen durch charakteristische Proteine mittels Elektrophorese
    • Elektronenmikroskopie, Bestimmte Strukturen und Dichte sind spezifisch für das jeweilige Organell.
unterschiede der n hrmedien
Unterschiede der Nährmedien
  • Aerob
  • Citratzyklus + Oxidative Phosphorylierung
  • Mitochondrien
  • Bis zu 12 ATP / Lactat
  • Niedrigere Zellausbeute zu erwarten
  • Anaerob, aber auch unter aeroben Bedingungen
  • Glycolyse + Fermentation zur Energiegewinnung bevorzugt
  • Cytosol
  • 2 ATP / Glucose
  • Pasteur-Effekt
  • Crabtree-Effekt
  • Höhere Zellausbeute zu erwarten

Lactat

Glucose

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

citratcyclus fermentation im vergleich
Citratcyclus & Fermentation im Vergleich

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

Lactat -> Pyruvat liefert keine Energie, deshalb erfolgt keine Fermentation sondern eine aerobe Verstoffwechselung durch den Citratzyklus

citratcyclus fermentation im vergleich 2
Citratcyclus & Fermentation im Vergleich 2

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

  • Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit Cytochrom b2
unterschiede im zellaufbau
Unterschiede im Zellaufbau
  • Atmungskette findet in den Mitochondrien statt- dadurch vermehrte Mitochondrien-Bildung
  • Höherer Anteil an ß-1,6-Glucan (verursacht langsameren Verdau) in der Zellwand
    • 50 min. bei 30°C mit Zymolyase
  • Fermentation findet im Endoplasmatischen Reticulum statt- dadurch vermehrte Mikrosomen-Bildung
  • Niedrigerer Anteil an ß-1,6-Glucan
    • 30 min. bei 30°C mit halber Zymolyase-Menge

Lactat

Glucose

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

proteinbestimmung nach lowry
Proteinbestimmung nach Lowry

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

Ablesen der Proteinmenge in der Messküvette aus gegebener Kalibrationskurve (c[µg/2,6mL] gegen Absorption)

markerenzymbestimmung
Markerenzymbestimmung

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

  • Benötigte Werte:
    • Aktivität ([ΔE/min], entspricht der Steigung), in dem Bereich, in dem die Steigung maximal ist!- umrechnen in Minuten
    • Volumen der Organellenfraktionen
    • Proteinkonzentration in der jeweiligen Fraktion
markerenzyme aktivit tsberechnungen
Markerenzyme- Aktivitätsberechnungen

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

  • Spezifische Aktivität [(ΔE/min)/mg]
  • Gesamtaktivität der Fraktion [ΔE/min]
markerenzyme reinheitsbestimmung
Markerenzyme- Reinheitsbestimmung

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

  • Ausbeute
  • Anreicherungsfaktor
  • Kreuzkontamination
quantitative cytochrombestimmung
Quantitative Cytochrombestimmung

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

Mittels Lambert-beer‘schem Gesetz

Wellenlängenpaar λBasis/λMax zur Bestimmung von ΔE

cytochrom berechnung
Cytochrom- Berechnung

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

Bestimmung erfolgt über Differenzspektrum der α-Banden

ΔE…Extinktionsunterschied zw. λmaxund λBasis

nicht vergessen
Nicht vergessen!

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch

Verdünnungen beachten

Einheiten

Taschenrechner

Schummelzettel

danke f r die aufmerksamkeit

Danke für die Aufmerksamkeit

Fragen?

Bernhard Berg, Peter Eibensteiner, Roland Nagl, Klara Treusch