革兰阳性耐药菌及实验室检测进展

1. 革兰阳性耐药菌及实验室检测进展 华鑫康都检验所 吕苏成

2. 主要内容 • 流行病学 • 主要耐药机制 • 检测方法 • 自动化仪器测定几种特殊细菌的药敏试验 • 对MRS、VRE、HLAR和PRP的用药建议

3. 一、流行病学 • 革兰阳性菌（GCP）： *感染增多 18% *耐药性增高 27% *多重耐药菌增多 48% *耐甲氧西林的菌株比率上升 葡萄球菌占71-100% 肠球菌占87.5-100%

4. （一）、葡萄球菌耐药率上升 • 耐甲氧西林葡萄球菌是医院内重要的病原菌，分离率逐年上升 ，多重耐药，在NCCLs指南中要求ß-内酰胺酶类药物全部报告耐药外，仅喹诺酮类、大环内脂类、氨基糖甙类和糖肽类（万古霉素）可选用，但其对上述药物中除万古霉素外已具70-90%的耐药性。

5. 国内外葡萄球菌监测 • 国内通过不同地区耐药监测，还未发现万古霉素耐药的菌株，但MRSA的发生率已达44%、MRSCON的发生率已达52%，ICU病房分离率可达90%。 • 在美国、法国、西班牙等MRSA的分离均可达30%以上。

6. 传播及易感人群 • 由于MRS传播途径广泛，如医患人员的手、呼吸道携带、肠道、物品等，因此易在院内引起爆发流行。 • 易感人群主要有继发性免疫低下人群，严重原发病组、大手术严重创伤、大面积烧伤组、恶性肿瘤和血液病等。

7. （二）、肠球菌 • 1979年首次有文献报道对高浓度庆大霉素耐药。 1988年英国首次报道肠球菌耐万古霉素菌株（VRE），肠球菌的耐药性逐年上升，主要表现为高水平耐氨基糖甙类和耐万古霉素的肠球菌。其中5%菌株可产生ß-内酰胺酶。

8. 国内监测结果 • 耐万古霉素肠球菌为2-5%,屎肠球菌耐药率远高于粪肠球菌。对庆大霉素耐药率已达70%以上，并且其中40-60%为高耐株。 • 高水平耐氨基糖甙类 ： 粪肠球菌占40% 屎肠球菌占60%

9. 肠球菌感染上升 • 肠球菌是条件致病菌，可引起软组织、腹和伤口感染、甚至入血造成菌血症，肠球菌在全部病原菌中所占比率在不断上升，国内结果表明： 1995 5.1% 1996 6.0% 1997 6.2% 1998 7.0% 1999 8.1% 2000 9.81%

10. 由肠球菌引起的感染性疾病 • 据文献报道：美国每年 尿路感染为11万例 菌血症2.5万例 外伤感染4.0万例 心内膜炎0.11万例 大多为院内感染。肠球菌败血症的死亡率可达7-50%。

11. （三）、肺炎链球菌 • 1963年巴西首次报道耐青霉素的肺炎链球菌。 • 1967-1977年均有连续报道。 • 1977年在南非发生多重耐药肺炎链球菌爆发流行（MDR），MDR不仅对青霉素G耐药，而且常常对四环素、红霉素、氯霉素、克林霉素、链霉素等药物耐药。

12. 国内外分离率 • 在美国、巴西、阿根廷、智利、南欧、南韩和日本PRP菌株分离率已达40%以上。 • 在我国，由于苛氧菌分离能力的差异，目前还无全国性报道，北京地区耐药监测结果为5-14%。北京、上海地区携带率调查结果表明： 北京地区为22-37% 上海地区为30.2% 急性呼吸道感染儿童咽部为37.8%

13. 二，主要耐药机制 • 耐甲氧西林葡萄球菌（MRS） • 肠球菌（VRE、HLAR） • 耐青霉素的肺炎链球菌（PRP）

14. (一)、MRS • 在细菌的内膜有ß-内酰胺酶的作用靶位称青霉素结合蛋白（PBPs). • 敏感的金葡菌的PBPs是PBP1，2，3，3’，4，而MRSA有一个独特的高分子量的PBP2’（或称2a）。 • PBP2a是一系列具有编码PBP2a调节表达功能的meC基因。

15. MeC基因 • MeC基因主要由调节基因mecR和结构基因mecA组成，mecR基因又有mecI和mecA1组成，在无诱导剂ß-内酰胺类药物的情况下，mecR的存在可抑制mecA基因的编码作用使PBP2a不能形成。

16. 辅助基因 • 近来研究还表明，还有一些辅助基因协同对ß-内酰胺类药物的高度耐药，这些基因称为femA、femB、femC、femD。 • Fem基因失活可增加细菌对ß-内酰胺类的敏感性。这一研究可为MRSA感染疾病的治疗药物的研究带来启迪。 • 但是在某些情况下，过度产ß-内酰胺酶的菌株也出现耐笨唑西林的表型。

17. （二）、VRE、HLAR • 肠球菌的耐药特点主要表现在青霉素，ß-内酰胺类抗生素，氨基糖甙类抗生素和万古霉素。 • 肠球菌具有固有的对多种抗生素的耐药性。 • 茯得性耐药及毒力特性常由质粒编码，而天然耐药是由染色体基因编码，是不可能传播的。

18. VRE、HLAR • 肠球菌对青霉素类天然低水平耐药，对头孢菌素天然耐药，80年代首次报道了对青霉素高度耐药的屎肠球菌。 • 肠球菌对青霉素类和头孢菌素的耐药性主要由低亲和性的PBP引起。 • 由于屎肠球菌的PBP与青霉素的亲和力明显低于粪肠球菌。

19. VRE、HLAR • 多重耐药的肠球菌（MDR）对高浓度庆大霉素和万古霉素的耐药性是通过共轭转座子编码耐药基因，信息应答质粒和其他广泛分布于宿主的质粒交换而获得耐药性。 • HLAR株是由于产生多种氨基糖甙修饰酶（AME），且一种AME即可对多种氨基糖甙药耐药。

20. 表现型 • 对万古霉素耐药的肠球菌表现型有三种: VanA型（耐万古霉素和替考拉宁） VanB型（耐万古霉素） VanC型（耐万古呈低度耐药、对替考拉宁敏感）

21. （三）、PRP PRP株的耐药机制是有6种PB发生拼图改变，因为PBP/1a/1b和PBP2a/2x/2b是ß-内酰胺类抗生素作用的致命靶位点，改变了靶位的肺炎链球菌与青霉素G的结合力下降。

22. 三、MRS检测方法之一 • 用1µ/片笨唑西林纸片检测其耐药性： 判断标准：金葡菌抑菌环≤10mm为R、11-12mm为I、≥13mm为S。 MIC:≥4ug/ml为R、≤2ug/ml为S。 表葡菌：≤17mm为R、≥18mm为S。 MIC:≤0.25ug/ml为S、≥0.5ug/ml为S。

23. MRS检测方法之二 • 琼脂筛选法：M-H琼脂4%Nacl和6ug/ml的笨唑西林，相当0.5麦氏单位菌悬液点种于上述平皿上，35℃24h培养，凡在此平皿上生长的金葡菌为MRSA，反之为MSSA。 已有文献报道单一浓度琼脂筛选法不适用于凝固酶阴性葡萄球菌。只用于mecA基因阳性的葡萄球菌。

24. MRS检测方法之三 • MecA基因检测： 目前大多采用PCR（Polymerse Chain Reaction）方法。MecA基因的检测可区别耐药株是由外源型青霉素结合蛋白a引起，还是自身PBP点突变或产生过量ß-内酰胺酶。

25. MRS检测进展 • 鉴定方法： 文献： 评价三种新的鉴定MRSA的方法的敏感性和特异性。 参考文献： J.Cli.Micro.2000 38（6）：2170-2173。

26. Velogene yapid MRSA检测 • （ID Biomedical Corp温哥华、加拿大）用探针方法鉴定为基因基础，从血琼脂取1ul接种环的菌落作悬液在50ul的裂解缓冲液中，置55℃20分钟，悬液再置干孵箱95℃5分钟。50ul循环试剂，加上述裂解悬液50ul置55℃＞25分钟。加入循环终止试剂，悬液转移到已包被链酶酸盐的微量反应孔，室温10分钟，加入底物，显色，兰色为mecA基因阴性，无色为MecA阳性。

27. MRSA-Screen乳酸筛选方法 • 已分离菌落与提取试剂混合煮开3分钟，冷却至室温，再取上述悬液加入第二提取试剂混合离心1500/分钟，再取上述提取液50ul加入三个一次性用反应卡上，各加一滴抗PBP2a单克隆抗体的致敏乳胶，3分钟看终点，出现颗粒为阳性。

28. BBL Crystal和PCR方法 • 用BBL Crystal MRSA ID系统，鉴定菌加入系统，35℃培养4h，用荧光装置观察。 • 多项PCR方法：略

31. SLIDEX STAPH PLUS乳胶凝集法检测金葡菌 • 通过三重检测机制，SLIDEX STAPH PLUS保证可靠、快速、准确的鉴定MRSA及MSSA。 • 包被有人类纤维蛋白原及多种单克隆抗体的蓝色乳胶颗粒可同时检测： 凝集因子（clumping factor） 蛋白A（proteinA） 金葡菌周边荚膜（peripherd capsule）上的特异抗原。

32. SLIDEX STAPH PLUS • 有些MRSA菌株只产生少量的凝集因子/蛋白A，或他们的受体被荚膜包被，因而难以被一般乳胶试剂检测出来。 • SLIDEX STAPH PLUS采用了多种抗特异抗原的高灵敏度单克隆抗体，能准确捕捉这些菌株。

33. Slidex staph plus • 50tetsts-Ref73115及250tetsts-Ref73116为生物梅里埃产品。 • 主要性能：无论是鉴定MRSA或MSSA均有最佳的特异性及灵敏度。 灵敏度：98.2%（MRSA及MSSA） 特异性：98.9% 以上数据来自业界学术研究，调查对象为449株金葡及443株非金葡菌株。 操作简单，判度准确，快速鉴定，全程只需30秒。

34. 肠球菌耐药机制检测

35. “I”人证 • 配制筛选琼脂：BHA含6ug/ml的万古霉素，10³菌数，培养35℃24h，凡生长者为VRE，反之为VSE。

36. HLAR测定 • 配制120ug/片庆大霉素和300ug/片链霉素。 当待测菌与上述二药中的任何一个出现≤10mm抑菌环时应告知临床用药方案。

37. PRP的检测 • 用1ug/片苯唑西林纸片代替青霉素纸片测定耐青霉素的肺炎链球菌。当抑菌环≥20mm时报告该待测菌青霉素为敏感，诺抑菌环≤19mm时用稀释法测试敏感性，而不能报告耐药。

38. 释稀法测定PRP的药物选择 • 青霉素、头孢噻肟、头孢曲松和万古霉素。 • 当血液、脑脊液，分离出菌株或严重感染疾病时因应直接用稀释法检测，可节约时间，早发报告。

39. 四、自动化仪器测定几种特殊细菌的药敏试验

40. MRSA监测功能之一 在用于葡萄球菌的药敏测试卡GPS-SA、GPS-SB、GPS-SC等，上述卡的苯唑西林反应孔内含2%Nacl使反应条件与筛选琼脂相一致，易于异质型菌株表型的检测。

41. MRSA监测功能之二 上述卡设有 二种苯唑西林测试浓度： 高浓度 低浓度 然而使地水平耐药菌株不会漏检。

42. MRSA监测功能之三 当待测菌对红霉素、庆大霉素耐药，而对苯唑西林敏感，系统会自动延长报告时间，防止慢反应菌株的漏检。因为MRS菌株常对红霉素、庆大霉素同时耐药。

43. VRE检测功能 在药敏卡GPS-TA、GPS-TB等链球菌测试中万古霉素反应孔中有4个，4个反应孔浓度选择有利于低耐的 VanC检测，并设置替考拉宁反应孔，可区别基因型。

44. HLAR检测功能 在药敏卡GPS-TA、GPS-TB药敏卡均没有庆大霉素500和链霉素2000测试孔，可检测待检菌是哪一种氨基糖甙类的高耐菌株，并以专家系统提出用药方案。

45. 耐肺炎链球菌的监测功能 Vitek-cc4不能作肺炎链球菌的药敏，但Vitek2可测定肺炎链球菌的药敏并设置了相应的监测功能。

46. 五.对MRS、VRE、HLAR和PRP的用药建议：

47. 1.对MRS菌感染的用药建议： 根据NCCLS指南提示，凡MRS菌株应报告全部В-内酰胺类药物为耐药，而不考虑其体外的敏感性。（包括青霉素类、头孢类。含酶抑制剂的复方制剂、氨曲南、泰能）。由于MRS常常同时耐大环内酯、氨基糖甙和喹诺酮类药敏，因此在严重感染经验用药时应首选万古霉素（稳可信）。在获得细菌室药敏报告后作纠正。

48. 2.对VRE或HLAR用药建议： 2.1 若对青霉素和氨基糖甙类药不耐药者，可用氨苄西林+链霉素或庆大霉素； 2.2 若细菌对青霉素类耐药，对氨基糖甙类敏感，则用头孢曲松或头孢噻肟+庆大霉素或链球菌，或环丙沙星+磷酶素+庆大霉素： 2.3 对VanB若菌株对氨基糖甙类不耐药者，用替考拉宁+庆大霉素；若为氨基糖甙高耐株则用替考拉宁+环丙沙星。有报道可用氯霉素或新生酶素+多西环素治疗成功的报道。

49. 2.4 有应用前景的新药： （1）可林沙星是新一代喹诺酮类药物； （2）链阳酶素为原始酶素IA、IB的衍生物； （3）亚唑烷酮类； （4）半合成糖肽。

50. 3.对PRP的用药建议： • 目前在我国凡不是青霉素耐药的肺炎链球菌，对青霉素和头孢类抗生素仍保持极好的敏感性，对青霉素耐药的肺炎链球菌可用头孢菌素来代替，特别是脑部感染是可用头孢噻肟和头孢曲松。若为多重耐药菌，可选用万古霉素。