王世鑫 武警医学院科研部 武警医学院蛋白质组学实验室

1. 医学科研思维方法 王世鑫 武警医学院科研部 武警医学院蛋白质组学实验室

2. 一、白色、黑色和灰色系统与医学研究 （一）客观世界划分为白色、黑色和灰色系统 系统论、信息论和控制论自从上世纪诞生以来，很快成为人们认识复杂客观世界新的哲学思想和方法体系。白色、黑色和灰色系统三个系统的划分，为科学研究从总体思维上廓清了大环境，为探索繁杂艰难的医学问题提出了一个可共选择的思维格局，便于根据问题的系统性状，来选择合理有效的研究技术和方法。从宏观上为医学科学研究建立了一个科学思维的框架。 第一节 医学科研的思维方法

3. 系统的组成、结构、功能和机制四个因素的信息都完全清楚的系统称为白色系统。如一台CT他的全部组成成分、内在结构、所具有的功能及操作运行机制都是完全清楚的。系统的组成、结构、功能和机制四个因素的信息都完全清楚的系统称为白色系统。如一台CT他的全部组成成分、内在结构、所具有的功能及操作运行机制都是完全清楚的。 白色系统是明朗的，过程是确切的。以往我们熟悉的科学研究大多属于白色系统问题。 1、白色系统

4. 系统的组成、结构、功能和机制四个因素的信息所知甚微的系统，称之。比如：人的大脑神经系统的思维活动、生物遗传系统、生长发育的基因调控等。由于黑色系统问题认识很少，就决定了对黑色系统类问题研究的探索性，研究过程的复杂性和研究结果的不确切性。甚至表现出一定的被动性和盲目性。 2、黑色系统

5. 系统的组成、结构、功能和机制等方面的信息都有部分把握的系统，称之。是介于白色与黑色之间的一类系统。比如人体生命过程，已了解了大体组成结构，基本生理功能及部分起支配作用的原理，然而，还有许多未知问题。如大脑、衰老、癌症等过程。系统的组成、结构、功能和机制等方面的信息都有部分把握的系统，称之。是介于白色与黑色之间的一类系统。比如人体生命过程，已了解了大体组成结构，基本生理功能及部分起支配作用的原理，然而，还有许多未知问题。如大脑、衰老、癌症等过程。 3、灰色系统

6. 从黑色系统到灰色系统，再到白色系统，不仅仅只是一种划分客观世界的思维框架，而且反映了人们认识客观事物研究认识层次的深化。从黑色系统到灰色系统，再到白色系统，不仅仅只是一种划分客观世界的思维框架，而且反映了人们认识客观事物研究认识层次的深化。 科学研究 白色系统 灰色系统 黑色系统 （二）白色、黑色和灰色系统间的相互关系 白色、黑色和灰色系统间的相互关系

7. 统计学是应用数学的一个分支，不仅可研究白色系统问题，更为重要的是，它能协助分析处理属于黑色系统领域的问题。统计学是应用数学的一个分支，不仅可研究白色系统问题，更为重要的是，它能协助分析处理属于黑色系统领域的问题。 黑色系统里的问题往往很难得到确切的结论，而统计学恰恰可以帮助对这种“不确定性”做出定量推测性结论。 白色系统类问题 一般数理化技术与方法 专业知识技术与方法 模糊数学技术与方法 灰色系统类问题 统计学技术与方法 黑色系统类问题 图 研究不同系统类问题所需的知识技术结构 （三）统计学是进出白色和和黑色系统的钥匙

8. 系统生物学根据胡德的定义，系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成分（基因、mRNA、蛋白质等）的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。 也就是说，系统生物学不同于以往的实验生物学——仅关心个别的基因和蛋白质，它要研究所有的基因、所有的蛋白质、组分间的所有相互关系。系统生物学是以整体性研究为特征的一种大科学。 二、整体、系统的思维方式

9. 美国能源部2002年启动了21世纪系统生物学技术平台美国能源部2002年启动了21世纪系统生物学技术平台 麻省理工学院和哈佛大学成立了系统生物学研究机构 中国科学院生命科学研究所与上海交大于2003年联合成立了上海系统生物学研究所 德国、日本、韩国、新加坡、菲律宾等国成立了系统生物学研究机构 系统生物学——全球发展热点

10. 系统生物学将是21世纪医学和生物学的核心驱动力。系统生物学将是21世纪医学和生物学的核心驱动力。 Leroy Hood，人类基因组计划的发起人之一

11. 世界上第一个系统生物学研究所 Institute for Systems Biology founded byLeroy Hood in 1999

12. 系统生物学的灵魂就是整合性思维方法，是指研究思路和方法的整合。和以往科学研究的区别：系统生物学的灵魂就是整合性思维方法，是指研究思路和方法的整合。和以往科学研究的区别： —经典的分子生物学研究是一种垂直型的研究。 即采用多种手段研究个别的基因和蛋白质。首先是在DNA水平上寻找特定的基因，然后通过基因突变、基因剔除等手段研究基因的功能；在基因研究的基础上，研究蛋白质的空间结构，蛋白质的修饰以及蛋白质间的相互作用等等。 —基因组学、蛋白质组学和其他各种“组学”则是水平型研究。 即以单一的手段同时研究成千上万个基因或蛋白质。

13. 系统生物学——整合性的研究方法 模型 数据 实 验 预测 模拟 生物系统 比 较 建立/修改模型 生物学知识

14. 系统生物学的思维特点，则是要把水平型研究和垂直型研究整合起来，成为一种“三维”的研究。 此外，系统生物学还是典型的多学科交叉研究，它需要生命科学、信息科学、数学、计算机科学等各种学科的共同参与。系统生物学研究所的第一篇研究论文，就是整合酵母的基因组分析和蛋白质组分析，研究酵母的代谢网络。

16. VEGF protein is secreted outside the cells and binds to its receptor on the endothelial cells to promote their growth.

17. 第二节 医学科研选题与创新

18. 创新是一个民族发展的灵魂，是科学研究的生命线，研究内容上的创新性是科研选题得以成立的根本条件。创新是一个民族发展的灵魂，是科学研究的生命线，研究内容上的创新性是科研选题得以成立的根本条件。 一、创新的意义 • 科学创新有三个层面的涵义： • 原始性创新； • 集成性创新； • 引进、消化型创新。 • 衡量课题的先进性，主要考核它的创新性如何。

19. 科技成果的创新度往往与其科研成果发表前论文检索的重复率和发表后论文检索的引用率具有一定的相关性。这种相关性主要表现为论文检索的重复率越大，其创新性越小，重复性越小，其创新性越大；论文检索的引用率越大，其创新性越大，引用率越小，其创新性越小。 二、创新度评价（理论）

20. 从科学计量学上，科技成果论文检索的重复率曲线(D)和论文检索的引用率曲线(S)之间在坐标系里必然存在一个均衡点。我们可以根据这个均衡点和均衡状态评价科技成果创新的程度。从科学计量学上，科技成果论文检索的重复率曲线(D)和论文检索的引用率曲线(S)之间在坐标系里必然存在一个均衡点。我们可以根据这个均衡点和均衡状态评价科技成果创新的程度。 创新度（P） D S P1 E Pe P2 D S 创新度（P） 创新度（P） O Q4 Q2 Qe Q1 Q3 科技成果数（Q） 科技创新的一般均衡曲线和均衡科技创新度的形成示意图 第一种情形是：当科技创新度为P1时，科技成果的引用数为Q1，而科技成果的重复数为Q2，形成科技成果引用率大于科技成果重复率。即OQ1>OQ2。科技创新度高。 第二种情形是：当科技创新度为P2时，科技成果的重复数为Q3，而科技成果的引用数为Q4，形成科技成果重复率大于科技成果引用率。即OQ3>OQ4。科技创新度低。

21. 根据以上科技创新的一般均衡曲线可以看出以下几种情况：根据以上科技创新的一般均衡曲线可以看出以下几种情况： (1)从一般均衡曲线上可以看到，E点以上部位的科研成果，由于其重复率小、引用率大，因此，其科技创新性就强，科技成果价值就大。反之，在E点以下，其创新性就弱，科技价值就小。 (2)当某项科研成果其重复率为零时，其科技成果引用率即反映出其创新程度；当其引用率为零时，其重复率即反映出其创新程度。 (3)当某项科技成果的重复率和引用率都为零时，表明此项科技成果的创新度为零。 (4)衡量科技成果创新度（科技价值）的大小既取决于其科技成果重复率大小，也取决于其科技成果引用率大小。重复率和引用率可以看成是科技研究领域非常重要的两种基本力量，它们之间的相互作用决定了科技成果创新性的大小。

22. 三、科研创新的来源 • 创新人才； • 创新环境和平台； • 创新制度； • 创新思维与学科交叉。

23. 第三节 临床蛋白质组学

24. 人类基因组计划 • Dulbecco 于1986年提出1990年由美国能源部和国立卫生院启动。 国际大合作：英、美、法、日、德、中 主要包括基因定位和全序列测序 遗传图、物理图、全序列

25. The public project estimates that there are 31000 protein-encoding gene, whereas Celera finds –26000, with many more still to be found. 6000 for a yeast 13000 for a fly 18000 for a worm 26000 for a plant (Genomes Online Database) Many Genome

26. “The total PROTEin composition of a genOME.” M. Wilkins et al. Electrophoresis 1995, 16, 1090-1094 Proteome describes the complete set of proteins that is expressed, and modified following expression, by the entire genome in the lifetime of a cell. It describes the composition of proteins expressed by a cell at any one time. Proteomes are dynamic!!!!!! Proteome

27. Duodenum smooth muscle Ileum adipose Thyroid gland Brain medulla oblongata Placenta whole Brain putamen Oesphagus smooth muscle Stomach fundus smooth muscle Ileum smooth muscle Oesphagus mucosa Kidney pelvis Lung whole Liver anterior right lobe Bladder fundus outer wall Blood vessel pulmonary artery Colon mucosa Colon taeni coli Pancreas whole Uterus myometrium (myometrial) Jejunum mucosa Blood vessel cerebral artery Stomach antrum smooth muscle Lung 2 bronchus Foreskin Lung trachae whole Brain frontal cortex Stomach fundus mucosa Lung parenchyma Stomach body mucosa Brain cerebellum Heart pericardium Pituitary gland whole Ceacum mucosa Ileum mucosa Spleen whole Brain amygdala Gall bladder whole Cell line 132N1 Brain hypothalamus Tonsil (lymph node) Brain caudate Ceacum smooth muscle Aorta whole Umbilical cord whole Bladder trigone Stomach body smooth muscle Testes whole Lung 4 bronchus Colon smooth muscle Kidney renal cortex Brain superior frontal gyrus Brain caudate putamen Brain striatum Cell line HeK293 Lung 1 bronchus Brain substantia nigria Kidney renal medulla Lung 3 bronchus Skeletal muscle Blood vessel basal artery Brain choroid plexus Brain hippocampus Kidney ureter Duodenum mucosa Protein Expression mRNA Expression 5 4 3 2 1 0

28. Differential Expression at Differential temperature A B E. Coli grown at 30º C E. Coli grown at 42º C

29. Proteomics is the study of protein properties on a large scale to obtain a global, integrated view of disease processes, cellular processes and networks at the protein level. Cytoplasmic proteins Proteomics

30. B kDa A P07155 P07155 25 Y43753 Y43753 5.5 5.5 pI 蛋白质组学包括： 功能 蛋白质组学 表达 蛋白质组学 结构 蛋白质组学

31. Genomics and Proteomics Structural Genomics DNA Functional Genomics RNA Structural Proteomics PROTEIN Functional Proteomics PROTEIN Protein Chips Yeast 2-Hybrid Transgenics 3-D Structure Bioinformatics Sequencing Mapping DNA Arrays Bioinformatics 2-D Gels Mass Spec Protein Chips Bioinfomatics Gene Expression DNA Arrays Transgenesis

33. VEGF protein is secreted outside the cells and binds to its receptor on the endothelial cells to promote their growth.

34. 一条是力图“查清”人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组数据库，即组成蛋白质组学；另一条途径，则是着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，以及细胞调控机制，同一条是力图“查清”人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组数据库，即组成蛋白质组学；另一条途径，则是着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，以及细胞调控机制，同 时获得对某些关键蛋白的定性和功能 分析，即比较蛋白质组学研究。 蛋白质组学研究途径

35. 组成蛋白质组学研究(结构蛋白质组学) 这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对生命活动的全景式认识。 但目前在短时间内建立人类蛋 白质组学“完整的”数据库和实现网 络资源共享的条件尚未成熟。

36. 虽然在微生物中，基因组、转录组基础上的蛋白质全谱研究已有成功报道，但在高等生物尤其是哺乳动物中未见报道，人类组织或细胞的蛋白质组全谱刚刚起步(肝)。开展筛选特定情况(疾病)下的蛋白质组中特殊标志蛋白与关键蛋白的研究(差异蛋白质虽然在微生物中，基因组、转录组基础上的蛋白质全谱研究已有成功报道，但在高等生物尤其是哺乳动物中未见报道，人类组织或细胞的蛋白质组全谱刚刚起步(肝)。开展筛选特定情况(疾病)下的蛋白质组中特殊标志蛋白与关键蛋白的研究(差异蛋白质 组学)，迅速推广应用，是一种更符 合中国国情的切实可行的研究途径。

37. 以生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理、病理过程的比较蛋白质组学研究，是比较蛋白质组学研究的核心。以生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理、病理过程的比较蛋白质组学研究，是比较蛋白质组学研究的核心。 正常对照组 矽尘暴露(0)组 可疑矽肺(0+)组 一期矽肺(I)组 补体C4 富含亮氨酸的α-2糖蛋白 α-1抗胰 蛋白酶 转铁蛋白 α-1抗胰 蛋白酶 图3 可疑矽肺（0+）组血清中表达有显著差异的蛋白质 比较蛋白质组学研究(差异蛋白组学、功能蛋白质组学)

38. 可以说差异蛋白质组学是功能蛋白质组学研究的一部分，通过参与不同生理病理过程蛋白质种类和数量的比较，寻找重要生理过程中的关键蛋白和导致疾病发生的标志性蛋白的这类研可以说差异蛋白质组学是功能蛋白质组学研究的一部分，通过参与不同生理病理过程蛋白质种类和数量的比较，寻找重要生理过程中的关键蛋白和导致疾病发生的标志性蛋白的这类研 究，现在正获得国内外临床 蛋白质组学研究者日益增多 的关注。 Healthy Diseased

39. 蛋白质组学的研究已涉及到临床的各个方面： 1.诊断： 如疾病筛查、疾病分期分型等。生物标志物(biomarker)。 对于在特定疾病中的特定蛋白质的深入研究，为疾病的病因、发病机制，疾病临床分期分型提供了分子基础。 2.指导治疗： 如病程分析、用药、手术时机的选择等。 　 3.提供药物开发的临床依据： 如确定药物靶点、新药开发等。 　 4.预后判断： 根据生物标志物在不同疾病中的变化，判断疾病性质和严重程度等。 临床蛋白质组学(clinical proteomics)

40. 临床蛋白质组学研究技术简介

41. 临床蛋白质组学（生物标志物发现）经典技术方案临床蛋白质组学（生物标志物发现）经典技术方案 生物样品(组织、体液、细胞、细菌或病毒等) 蛋白质研究关键技术 产 品 Products 样本预处理 2-D 胶 总蛋白酶解混合物 结构研究/ 细胞筛选 cDNA克隆/重组表达/ 药物设计/ 疾病诊断等 A B C 染色图象分析 Nano-HPLC cICAT(Duplex Samples)与iTRAQ(Multiplex Samples) 生物标志物的发现(BioMarker) 酶解 2 肽 混 合 物 Biomarkers功能研究 4800 MADI-TOF-TOF 蛋白质鉴定PROTEIN ID 蛋白质信息学/数据库检索 Bioinformatics 蛋白质翻译后修饰鉴定 肽质量指纹谱(PMF) 肽碎片序列测定(MSMS)

42. (一)蛋白质指纹技术（SELDI-TOF/MS） 疾病早期预警新里程碑

43. 化学表面 – 蛋白质表达剖析 : (反相疏水) (阴离子) (阳离子) (金属离子) (正相亲水) 生物表面 – 蛋白质相互作用检测: (PS-1 or PS-2) (抗体 – 抗原) (受体- 配体) (DNA – 蛋白质) 蛋白芯片表面介绍

44. 化学表面芯片的蛋白质剖析过程 洗脱条件 Wash Conditions 飞行质谱检测Measured m/z pH Salt Urea Water CHAPS Organic Imidazol 60 Detergent 5807.5 40 20 0 2500 5000 7500 10000 芯片表面类型 Surface Type

45. (二)液体芯片技术路线简图

46. 血清蛋白组学分析策略 1. 血清总蛋白差异蛋白组分析 血清蛋白组学分析 2. 血清糖蛋白差异蛋白组分析 3. 血清低分子量蛋白蛋白组分析

47. 血 清 结果鉴定 样品处理 (三)基于双向电泳的血清蛋白质组学研究 切点酶解 MS图谱

48. 血清样品处理 技术路线 二维电泳 数据分析及差异点切割 MALDI TOF/TOF 鉴定 ESI MS/MS 鉴定 否 成功 成功 Western Blotting 验证 Real time PCR 验证 进一步的功能实验及药物靶标的分析 生物信息学分析

49. (四)悬浮芯片及临床应用

50. 由100种不同颜色标记的一系列微球体（xMAP技术）组成，每个微球体可偶联一个对应的不同靶分子特异反应物。由100种不同颜色标记的一系列微球体（xMAP技术）组成，每个微球体可偶联一个对应的不同靶分子特异反应物。 能同时对在不同基质包括细胞培养悬浮液、血清和血浆中的细胞因子、生长因子等进行定量测试。 大多数试验，每次仅需12µL的样本量。 悬浮芯片技术(SAT)