1 / 36

生物化学与分子生物学实验教学中心

层 析 法 Chromatography. 生物化学与分子生物学实验教学中心. 基本概念 层析法的分类 几种常用的层析方法 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析. 基本概念. 层析法 通过在 固定相 和 流动相 之间的物理和化学分配差异将 混合物 中的两种或多种化合物相互分离的方法之总称。. 所有的层析系统都由两个相组成：一是 固定相 ，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是 流动相 ，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。.

abedi
Download Presentation

生物化学与分子生物学实验教学中心

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 层 析 法Chromatography 生物化学与分子生物学实验教学中心

  2. 基本概念 • 层析法的分类 • 几种常用的层析方法 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析

  3. 基本概念 • 层析法 通过在固定相和流动相之间的物理和化学分配差异将混合物中的两种或多种化合物相互分离的方法之总称。

  4. 所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。

  5. 层析法利用混合物中各组分的理化性质（如溶解度、吸附能力、电荷、分子量、分子极性、亲和力等）各不相同，使各组分在流动相中移动速度不同而集中分布在不同的区域，借此将各组分分离。

  6. 反复进行 + 流动相 组分A 移动速度不同 组分B 组分A 组分B 吸附 结合等 固定相 解除上 述作用

  7. 固定相 液体 固体 气-液 层析法 气-固 层析法 气相层析 流 动 相 气体 液-液 层析法 液-固 层析法 液相层析 液体 层析法的分类 • 按两相所处的状态分类

  8. 按层析原理分类 名 称 分 离 原 理 吸附层析法 各组份在吸附剂表面吸附，固定相是固体吸附剂，对各组分吸附能力不同 分配层析法 各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同

  9. 续上表 名 称 分 离 原 理 离子交换层析法 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂形成的盐键数目不同 凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同 亲和层析法 固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此与无亲和力的其它组份分离

  10. 按操作形式不同分类 名 称 操 作 形 式 柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离 薄层层析法 将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离

  11. 续上表 名 称 操 作 形 式 纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离 薄膜层析法 将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离

  12. 几种常用的层析方法 • 吸附层析 • 分配层析 • 离子交换层析 • 凝胶层析 • 亲和层析

  13. 吸附层析（Absorption chromatography） 吸附层析是利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行分离的一种方法，常用于分离易溶于有机溶剂而难溶于水的混合物。

  14. 吸附柱层析(Absorption column chromatography) 吸附柱层析是利用玻璃柱盛固定相。样品溶液加入层析柱，溶质即被吸附剂（固定相）吸附。待样品液全部流入柱内的吸附剂后，再加入适当的洗脱液（流动相），使被吸附的溶质逐步解吸下来，随着洗脱液向下流动而移动，最后被分离。

  15. 柱层析示意图

  16. 趣味实验：　柱层析法 【实验步骤及现象】 废旧的酸式滴定管 装柱：脱脂棉堵住底部活塞出口，管中装入研细的粉笔末，用玻璃棒轻轻压实、压均匀 加样：柱上盖一张滤纸，滴加1～2滴红、蓝墨水的等量混合物（可适当加些水） 展开：墨水混合液沿柱向下移动，逐渐形成不同的色带，红色带在下，蓝色带在上。

  17. 【简易的方法】取一只白粉笔，在距大头一端的2 cm处，用笔蘸上墨水画一个圈（墨水是红、蓝墨水的等量混合液）。将粉笔的大头朝下，立在盛有适量水的培养皿中。水作展开剂，随着水沿粉笔的上升，带动红、蓝墨迹向上移动。由于红墨水上升得快，所以红色带在上方；由于蓝墨水上升得慢，所以蓝色带在下方。这样便形成了柱色谱。

  18. 薄层吸附层析（Thin layer absorption chromatography） 薄层吸附层析是将吸附剂均匀地铺在玻璃板上成薄层，再把样品点在薄层上，点样的位置靠近板的一端。然后将该端浸入适当的溶剂（流动相）中，使溶剂在薄层板上扩散，并在此过程中通过吸附→解吸→再吸附→再解吸的反复进行，而将样品各个组分分离出来。

  19. 吸附剂的选择 • 最大表面积和足够的吸附能力 • 对欲分离的物质有不同的吸附能力 • 与溶剂和样品不会发生化学反应 • 颗粒均匀，不会碎裂

  20. 分配层析（Partition chromatography） • 根据物质在两种不相混溶（或部分混溶）的溶剂间溶解度不同，从而有不同的分配来实现分离的方法。属于液—液层析。

  21. 固定相中溶质的浓度 K = 流动相中溶质的浓度 分配层析 • 分配系数（K）

  22. 离子交换层析（Ion-exchange chromatography） 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。

  23. 离子交换剂的种类 H+ 磺酸基（—SO3H） 强酸型 阳离子 交换剂 酚羟基（— OH） 弱酸型 — 羧基（—COOH） — 季胺碱（—N+R3） 强碱型 阴离子 交换剂 伯胺基（—NH2） 弱碱型 仲胺基（—NHR） 叔胺基（—NR2） OH-

  24. 电荷性质不同 离子交换层析示意图

  25. 电荷量不同

  26. 凝胶层析（Gel filtration chromatography） 凝胶层析是指混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。

  27. 分子筛效应 大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布在颗粒之间，其流程短，遇到的阻力小，所以在洗脱时向下移动的速度较快，先流出层析柱 。

  28. Size-exclusion chromatography 凝胶过滤层析

  29. 凝胶的种类和性质 • 交连葡聚糖凝胶 • 琼脂糖凝胶 • 聚丙烯酰胺凝胶

  30. 亲和层析（Affinity chromatography） 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。

  31. 亲和层析 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。

  32. 亲和吸附 （生物高分子与配体专一结合） 配体与载体结合 （固相化） 洗柱 亲和层析的基本过程 装柱 （亲和层析柱）

  33. Affinity Chromatography 亲和层析

  34. 亲和层析的实验室应用举例 • 用Ni柱纯化带有His标签（ 6×组氨酸）的融合蛋白 ： 应用最广泛 • 谷胱甘肽S转移酶（GST）-tag纯化法： 利用谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶之间酶和底物的特异性的作用力

  35. 小 结 • 层析法概念： 利用混合物中各组分的理化性质（如溶解度、吸附能力、电荷、分子量、分子极性、亲和力等）各不相同，通过在固定相和流动相之间的物理和化学分配差异将混合物中的两种或多种化合物相互分离的方法之总称。

  36. 几种常用的层析方法 • 吸附层析 • 分配层析 • 离子交换层析 • 凝胶层析 • 亲和层析

More Related