植物转基因技术 郭仰东 中国农业大学

1. 植物转基因技术 郭仰东 中国农业大学

2. 植物遗传转化 植物遗传转化（plant genetic transformation） 是指将外源基因转移到植物体内稳定地整合 表达与遗传的过程。 建立稳定高效的转化体系是先决条件。

3. 植物遗传转化 至今人们已获得的转基因农作物包括水稻、小麦、玉米、棉花、大豆、番茄等。 国外已经批准上市的转基因作物有棉花、大豆、番茄等，我国也于1996年批准了第一个转基因延熟番茄商品化。

4. 根据基因转化系统的原理可以将转基因技术分为：根据基因转化系统的原理可以将转基因技术分为： (1) 以质粒DNA等为载体的转化系统，如农杆菌法，迄今为止所获得的转基因植物中大部分是利用根癌农杆菌转化而来的。 (2) 不用任何载体，通过物理化学方法直接将外源基因导入受体细胞的直接转化系统，如微针注射法、基因枪法。 (3) 以植物自身的生殖系统种质细胞，如花粉粒或其他细胞等为媒体的转化系统，如花粉管通道法。

5. 主要方法： 农杆菌法(agrobacterium mediated transformation) 基因枪法(particle bombardment) 花粉管通道法(pollen-tube pathway) 显微注射法(microinjection) 电击法(electroporation) 聚乙二醇法（PEG）

6. （1）农杆菌介导基因转化的原理 • 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，与植物基因转化有关的有两种类型：一为根癌农杆菌，它含有Ti质粒，诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤；二为发根农杆菌，它含有Ri质粒，能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。 • Ti质粒和Ri质粒是植物基因转化的理想载体系统。植物基因转化必须有质粒上T-DNA和vir基因即毒性区两部分的参与。

7. T - DNA • T - DNA携带的基因编码产物能促使生长素和细胞分裂素的合成，导致了转化植物的冠瘿瘤形成，在此过程中，T - DNA转移到植物细胞并整合到染色体基因组。

8. T - DNA • T - DNA上较重要的是T - 区两端左右边界各为25bp的重复序列。其中14bp是中心，分10bp和4bp两组，是完全保守的。这两个边界是T - DNA 转移所必需的。 • T - DNA 整合到植物基因组中后可以向子代传递,基本上保持T - DNA整合部位的稳定性,并遵循孟德尔遗传规律。

9. Vir基因 • vir基因的染色体基因包括Ch2vA 和ChvB、att、pscA、ChvD 以及ChvB 。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责使细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。 • Ti质粒的vir区大小为30kb，分VirA、B、C、D、E、G、H 等7个操纵子，一共有24个基因共同控制着T - DNA的加工和转移，它们总称调控子。

10. vir基因的活化转录是在接受了植物细胞产生的创伤信号分子后开始的。vir基因的活化转录是在接受了植物细胞产生的创伤信号分子后开始的。 • 具体过程：（阅读）首先是VirA基因的活化。VirA蛋白的胞质域有自激酶的功能，可在保守的组氨酸残基上，从而使VirG蛋白活化。VirG蛋白是DNA 结合活化蛋白，可以二体或多体形式结合到vir启动子的特定区域，从而成为其它vir基因转录的激活因子，打开VirB、C、D、E、H 等几个基因。

11. （2）农杆菌介导基因转化的载体系统 • 双载体系统将Ti质粒分成穿梭载体和辅助质粒 • 辅助质粒永久地存在于农杆菌寄主中，携带有毒性基因。 • 穿梭载体非常小并含有T - DNA边界序列，能在广泛寄主细胞中复制，同时具有抗生素抗性标记和作为外源基因整合的多个克隆位点。

12. 共整合载体系统是指Ti质粒上编码致瘤基因的序列被一段pBR322 DNA 所取代，带外源基因的pBR322衍生中间载体由大肠杆菌转入农杆菌后，二者相同的pBR322序列发生同源重组，外源基因就此整合到disarmed Ti质粒上。

13. （3） 农杆菌介导的基因转化方法 用农杆菌转化植物的基本程序： • 含有质粒的农杆菌与培养的植物细胞或受伤组织共培养； • 植物细胞在选择培养基中增殖； • 改变生长培养基中的激动素和细胞分裂素的水平使转化细胞分化成转基因植株。

14. 2、基因枪法 • 基因枪法是利用一种仿枪结构的装置，将表面吸附有外源遗传物质的金属颗粒直接射入受体，其表面吸附的外源DNA也随之进入细胞，是目前将外源DNA导入完整植物组织或原生质体中的一种有效的技术。 • 这种方法的优点是能应用于任何完整植物组织或植物细胞的区域，还可将任何DNA片断用于转化程序中。其缺点就是在整合过程中DNA片段可能会随机丢失。

15. Gene Transformation • * Biolistic Transformation

16. pDV413 PGGLI DraI P -100 Act I1 UidA TNOS

17. 3、 微注射法 • 该项技术是将外源目的基因经剪切制备成一定浓度的DNA溶液，装入一个带注射器的玻璃微针内，将DNA直接注射到固定好的单个活细胞中。随着细胞的发育，部份外源DNA就随机地整合到受体植物基因组中，经适当方法的筛选便能获得转基因植株。

18. 该法的缺点是被注射的细胞数量较少，但是在每个被注射的细胞中DNA 插入的成功率较高。用该方法已从甘蓝型油菜花粉胚获得转基因植株, 从原生质体获得转的愈伤组织。

19. 4、花粉管通道法 • 花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道，直接将外源DNA导入,转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，实现目的基因的转移。

20. 花粉管通道法是选择植株整体为受体，省略了细胞组织培养的继代及诱导过程，排除了植株再生的障碍。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞，使导入的DNA 易于整合，进入受体基因组的是部分DNA片断或目的基因。因此，转移基因所控制的性状在受体植株中易于稳定，节约了育种时间。

21. 1、抗虫转基因的研究 2、抗病转基因的研究 3、抗除草剂转基因的研究 4、延熟与保鲜转基因的研究 5、抗逆转基因的研究

22. 1、抗虫转基因的研究 抗虫育种中应用的较多的是： • 来源于细菌的Bt杀虫晶体蛋白基因 • 来源于植物的蛋白酶抑制剂(PI)基因 • 植物凝集素基因

23. （1）转Bt杀虫蛋白基因 • Bt杀虫蛋白基因是一种苏云金芽孢杆菌毒素蛋白(ICP)，平时以原毒素的形式存在，不具有杀虫活性。当昆虫取食后,在昆虫的消化道内（碱性环境），原毒素被活化，转型为毒性多肽分子，并与昆虫肠道上皮细胞上面的特异性蛋白质结合，之后ICP全部或部分嵌合于细胞膜中，使细胞膜产生一些孔道，从而导致细胞渗透平衡的破坏，最终导致昆虫幼虫的死亡。

24. （2）转蛋白酶抑制剂基因 • 蛋白酶抑制剂是一类植物天然抗虫蛋白质，喂饲昆虫后可与昆虫消化道内的蛋白消化酶相结合，形成酶抑制剂复合物，从而阻断或减弱蛋白酶对于外源蛋白质的水解作用，导致蛋白质不能被正常消化，使昆虫产生厌食反应，导致其发育不正常或死亡。

25. 目前已有多种蛋白酶抑制剂基因被导入植物，其中来自豇豆的胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因具有抗虫效果好、抗虫谱广等优点, 在油菜、马铃薯等作物中转化后对鳞翅目和鞘翅目害虫能产生良好抗性。

26. （3） 转植物凝集素基因 • 植物凝集素是指含有至少一个非催化结构并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的所有植物蛋白。它通过在昆虫的消化道中与肠道膜上的糖蛋白结合，从而影响营养的吸收，抑制害虫的生长发育繁殖，甚至杀死害虫。 • 目前在作物上应用较多的是雪花莲凝集素(GNA)基因。

27. 2、抗病转基因研究 • 转抗病毒病基因的技术有: • 导入病毒外壳蛋白基因(CP) • 利用病毒卫星RNA • 利用植物本身编码的抗病毒基因 • 利用病毒反义RNA技术 • 利用病毒复制酶基因

28. 在作物上用的最多的是病毒的外壳蛋白(CP)基因。该方法是首先将CP基因克隆出来，然后通过基因导入方法对植物进行转化，将CP基因导入植物细胞染色体，并进而获得抗性植株。在作物上用的最多的是病毒的外壳蛋白(CP)基因。该方法是首先将CP基因克隆出来，然后通过基因导入方法对植物进行转化，将CP基因导入植物细胞染色体，并进而获得抗性植株。

29. 3 、抗除草剂转基因研究 • 抗除草剂的基因转化主要有以下两种途径: 一是转入能降解除草剂的酶基因来消除除草剂对作物的危害作用,目前应用较多的是来源于潮湿链霉菌bar基因,此基因编码的蛋白可将除草剂膦丝菌素(PPT)乙酰化使其失去毒力。 二是对除草剂作用的靶蛋白进行修饰,使其对除草不敏感,或者促使这种靶蛋白过量表达,使植物在吸收除草剂后仍能进行正常代谢。

30. 4、延熟与保鲜转基因的研究 • 抑制细胞壁的降解 • 抑制乙烯的合成

31. （1）抑制细胞壁的降解 • 多聚半乳糖醛酸酶(PG)是一种组织特异性表达基因，只在果实成熟上特异表达，是果实成熟过程中的关键酶之一,它具有降解细胞间果胶质的作用,对于果实软化有很大影响。 • 阻止细胞壁水解酶活性，就可有效的抑制果实的成熟与衰老。 • 美国Cal2gene公司将反义PGcDNA导入到番茄中,育成FLAVR-SAVR转基因品种，于1994年批准上市,成为转基因植株商品化的首例。

32. （2）抑制乙烯的合成 • 许多果实的成熟脱落及衰老等生理过程是由乙烯合成直接控制的，而ACC合成酶基因在乙烯合成过程中起关键作用，如果用ACC合成酶和ACC氧化酶的反义RNA表达就会延迟成熟。 • 1991年Paul等人将ACC合成酶的一个cDNA反义系统导入番茄，转基因植株乙烯合成严重受阻，这种果实在空气中放置不能正常成熟，只有通过外源乙烯或丙烯处理，果实才能成熟变软，表现正常果实的颜色和风味。

33. 5、抗逆的转基因研究 • （1）耐盐转基因　 • （2）抗冻转基因　

34. （1） 耐盐转基因 • 目前通过基因工程技术提高植物的耐盐性有两种策略： （一）利用小分子渗透调节物质的代谢以及过量表达清除活性氧自由基,也称间接保护机制策略。目前,与这些渗透物质积累相关的一些酶类基因已经得到了克隆和鉴定,如脯氨酸合成酶(proA)基因、甜菜碱脱氢酶(BADH)基因、磷酸甘露脱氢酶(mtlD)基因以及与甘氨酸甜菜碱生物合成相关的酶类基因。

35. （二）降低由于盐胁迫植物细胞离子均衡受到破坏而产生的高Na+的毒害,调节细胞的K+/Na+比率,维持其高K+低Na+的离子平衡,也称直接保护机制策略。（二）降低由于盐胁迫植物细胞离子均衡受到破坏而产生的高Na+的毒害,调节细胞的K+/Na+比率,维持其高K+低Na+的离子平衡,也称直接保护机制策略。 • 另外，将耐盐植物的总DNA直接导入不耐盐植物，也能提高耐盐性。

36. （2） 抗冻转基因 • 在作物的抗冻转基因方面,利用的较多的是来自于北极深海鱼类的抗冻蛋白(AFP),将这种抗冻蛋白(AFP)基因分离并导入植物,具有抗冻的效能。 • 美国的Tower等将鲽鱼科的抗冻基因转入番茄,发现其具有抑制冰块重新结晶的能力,从而使蔬菜免遭冻害，且番茄在收获后的贮藏期间表现出良好的抗冻性，有助于提高果蔬的口感和品质。

37. 选择标记基因和报告基因 为了便于对转化细胞,组织,器官,植株进行选择，以及外源基因表达的研究，在构建载体时需将选择标记基因，报告基因和目的基因一并搭载在载体上。

38. 选择标记基因和报告基因 选择标记基因包括抗生素抗性基因和除草剂抗性基因等。在选择压力下，不含标记基因及其产物的非转基因细胞，组织，器官和植株均死亡。转基因植株将正常生长。新霉素磷酸转移酶基因（npt II）, 潮霉素B磷酸转移酶基因（hpt）比较重要。

39. 报告基因能快速报告细胞,组织,器官,植株是否被转化，是一个表达产物容易被检测的基因。GUS最普遍。GFP.报告基因能快速报告细胞,组织,器官,植株是否被转化，是一个表达产物容易被检测的基因。GUS最普遍。GFP.

40. 基本程序 受体细胞 侵染 杀死农杆菌 丛生芽 筛选培养 植株再生 分子检测 转基因植株

41. 分子检测方法 PCR: 以目的基因为引物，以转基因植物基因组DNA为模板进行体外扩增。 RT-PCR：以转基因植物总RNA为模板进行反转录，在经PCR扩增，如果从细胞总RNA得到特异的cDNA扩增条带，则表明外源基因实现了转录。 Southern：以外源目的基因序列作为探针，与转基因植物基因组DNA进行杂交。检测外源基因的存在及其拷贝数。

42. GMO Crops Delivery of a corn-based edible vaccine Tomatoes comes in many varieties, colors and shapes Transgenic tomatoes - expressing different malarial antigens

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47. Golden rice contains increased levels of pro-vitamin A • Traditional rice is white • The prototype of golden rice was developed in 2000 and is a light yellow color . It contains 1.6 mg/g of carotenoid. • c) In 2005, new transgenic lines were developed that dramatically increased the amount of carotenoid synthesized, deep golden color, this latest form contains 37 mg/g of carotenoid.