脑星形细胞肿瘤中 Survivin 基因的表达及其病理意义 研究生 曹晓蕾 导 师 陈 莉

1. 脑星形细胞肿瘤中Survivin基因的表达及其病理意义脑星形细胞肿瘤中Survivin基因的表达及其病理意义 研究生 曹晓蕾 导 师 陈 莉

2. 脑星形细胞肿瘤是中枢神经系统中最为常见的一类肿瘤，约占颅内肿瘤的30%，可发生于各个年龄期，尤以30-40岁为高峰发病年龄[1]。由于脑星形细胞肿瘤无论分化高低均呈浸润性生长，因此多数病人远期疗效较差，即使经过标准治疗（手术+放疗+全身化疗）后，仍难以达到根治。一般认为其中位生存期不足1年[2],是一类严重危害人类健康的疾病。脑星形细胞肿瘤是中枢神经系统中最为常见的一类肿瘤，约占颅内肿瘤的30%，可发生于各个年龄期，尤以30-40岁为高峰发病年龄[1]。由于脑星形细胞肿瘤无论分化高低均呈浸润性生长，因此多数病人远期疗效较差，即使经过标准治疗（手术+放疗+全身化疗）后，仍难以达到根治。一般认为其中位生存期不足1年[2],是一类严重危害人类健康的疾病。

3. 对肿瘤发生发展的机制研究中越来越多的证据显示细胞凋亡异常与细胞恶性增殖和分化受阻一样，在大多数恶性肿瘤的发病学上起重要作用，涉及到细胞凋亡信号途径的所有方面。其中，研究最深入、广泛的是凋亡抑制基因和凋亡活化基因的异常。对肿瘤发生发展的机制研究中越来越多的证据显示细胞凋亡异常与细胞恶性增殖和分化受阻一样，在大多数恶性肿瘤的发病学上起重要作用，涉及到细胞凋亡信号途径的所有方面。其中，研究最深入、广泛的是凋亡抑制基因和凋亡活化基因的异常。

4. 凋亡蛋白抑制因子家族（inhibitor of apoptosis proteins ，IAPs）新成员Survivin可抑制多种凋亡刺激因子引起的凋亡，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin mRNA在大多数正常组织中无表达[3] ,广泛表达于人类各种肿瘤组织。其独特的结构，选择性的细胞内分布的特点，具有明显细胞周期性，只在G2/M期表达，自1997年被发现以来，Survivin与肿瘤的关系已成为研究热点。

5. 肿瘤的生长、局部浸润及转移依赖血管形成，因此，肿瘤组织内的微血管形态、分布、数量等对肿瘤的生长、治疗和预后至关重要。星形细胞肿瘤分化程度较低时，肿瘤常有出血、坏死。因而对星形细胞肿瘤中血管生成的研究更为重要。CD34作为一种公认的血管内皮标记物，可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究，因此可通过CD34的单克隆抗体标记星形细胞肿瘤中的微血管（MV），在镜下（10×20倍）计算MVD,以探究星形细胞肿瘤中血管形成的规律。肿瘤的生长、局部浸润及转移依赖血管形成，因此，肿瘤组织内的微血管形态、分布、数量等对肿瘤的生长、治疗和预后至关重要。星形细胞肿瘤分化程度较低时，肿瘤常有出血、坏死。因而对星形细胞肿瘤中血管生成的研究更为重要。CD34作为一种公认的血管内皮标记物，可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究，因此可通过CD34的单克隆抗体标记星形细胞肿瘤中的微血管（MV），在镜下（10×20倍）计算MVD,以探究星形细胞肿瘤中血管形成的规律。

6. 本实验将应用免疫组化和RT-PCR的方法检测70例脑星形细胞肿瘤中Survivin的表达，同时结合临床随访资料，探讨Survivin表达与脑星形细胞肿瘤的临床因素、肿瘤病理分级、MVD以及预后之间的关系。本实验将应用免疫组化和RT-PCR的方法检测70例脑星形细胞肿瘤中Survivin的表达，同时结合临床随访资料，探讨Survivin表达与脑星形细胞肿瘤的临床因素、肿瘤病理分级、MVD以及预后之间的关系。

7. 一、材料与方法

8. ㈠标本 人脑星形细胞肿瘤标本70例，分别由南通医学院病理教研室、南通医学院附属医院病理科、常州市第一人民医院病理科提供，为1996-2002年常规外检的病理蜡块。其中男48例，女22例，年龄20-77岁，平均年龄49.3岁。根据世界卫生组织的年龄分期标准以44岁为界，将本文病例分为青年组（≤44岁）和中老年组（＞44岁）两组。

9. 标本均经过常规病理组织学检查，双盲法根据瘤细胞多形性、核分裂、肿瘤中出血坏死、肿瘤血管形成等按照WHO标准进行分级：Ⅱ级10例，Ⅲ级26例，Ⅳ级34例。其中26例标本同时有新鲜肿瘤组织保存于－70℃低温冰箱（Ⅱ级3例，Ⅲ级7例，Ⅳ级16例）。另取1例源于交通事故脑外伤手术患者的100mg脑新鲜组织、5例非正常死亡的人脑组织蜡块分别作为正常对照组，由南通医学院附属医院脑外科及南通医学院法医教研室提供。标本均经过常规病理组织学检查，双盲法根据瘤细胞多形性、核分裂、肿瘤中出血坏死、肿瘤血管形成等按照WHO标准进行分级：Ⅱ级10例，Ⅲ级26例，Ⅳ级34例。其中26例标本同时有新鲜肿瘤组织保存于－70℃低温冰箱（Ⅱ级3例，Ⅲ级7例，Ⅳ级16例）。另取1例源于交通事故脑外伤手术患者的100mg脑新鲜组织、5例非正常死亡的人脑组织蜡块分别作为正常对照组，由南通医学院附属医院脑外科及南通医学院法医教研室提供。

10. ㈡主要试剂 1.免疫组化试剂 兔抗人Survivin多克隆抗体（RAB-0536）、鼠抗人CD34单克隆抗体（MAB-0034）、超敏SP（鼠/兔）试剂盒（KIT-9710）、DAB显色试剂盒（DAB-0031）均为即用型，购自福建迈新生物技术有限公司。 2.RT-PCR试剂 RT-PCR试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司，包括Trizol、 RT试剂盒、PCR试剂盒、Survivin引物合成、β-actin引物合成。DL2000 DNA Marker购于 TaKaRa公司。

11. ㈢方法 1.RT-PCR检测Survivin基因的表达 ⑴组织中总RNA的提取 ①取保存于-70℃冰箱中的人脑星形细胞肿瘤组织、正常人脑组织各约50-100mg（相当于1到2粒米粒大小），置于1.5ml玻璃匀浆器中，加入1mlTrizol充分匀浆。 ②将匀浆液转至1.5ml灭菌EP管中，室温静置5分钟。 ③加入0.2ml氯仿，震荡15秒，静置2分钟。 ④4℃离心，12000g×15分钟，取上清（100μl枪轻轻吸）。 ⑤加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟。 ⑥4℃离心，12000g×15分钟，弃上清。

12. ⑦加入1ml75%酒精，轻轻洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5分钟，弃上清。⑦加入1ml75%酒精，轻轻洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5分钟，弃上清。 ⑧晾干，根据提取的RNA量加入适量的DEPC水溶解（65℃促溶15分钟）。 ⑨使用蛋白核酸定量仪定量：实际RNA浓度（mg/ml）=测得的RNA浓度×50/1000。 ⑩RNA变性胶电泳，电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察条带，判断组织中的RNA是否降解。

13. ⑵ cDNA第一链的合成（20ul体系） 按以下次序将各成分加入一0.5mlEP管中 5×RT buffer 4.0ul dNTP Mix（10mM） 2.0ul Oligo(dT)18Primer(0.5ug/ ul) 1.0ul 逆转录酶 1.0ul 酶抑制剂 0.5ul DEPC水 9.5ul 模板链RNA 2ul 总体积 20ul 42℃，1小时，70℃，10分钟。

14. ⑶PCR操作步骤（20ul反应体系） 按下列次序将各成分加入一0.5ml的离心管中 10×PCR Buffer 2.0ul Mg2++ 1.5ul dNTP mix（2mM） 2.0ul Survivin特异性primer（10pmol/ul） 2.0ul cDNA模板 2.0ul 双蒸水 8.1ul TaqDNA聚合酶 0.4ul

15. 94℃，3分钟 94℃，45秒（变性） ↙37次↖ 50℃1分钟 72℃1分钟 72℃，5min 4℃保存 （褪火） （延伸） （总延伸） 于第8个循环72℃、35秒时按暂停，加入2ulβ-actin特异性引物。 Survivin目的基因产物为377bps， 其序列：上游5’TATCTGCCAGACGCTTCCTA3’ 下游5’ATGACCTCCAGAGGTTTCCA3’ β-actin目的基因产物为495 bps， 其序列：上游5’AAGTACTCCGTGTGGATCGG3’ 下游5’ATGCTATCACCTCCCCTGTG3’

16. ⑷PCR产物的检测和分析 取PCR产物5ul + 6×lodding 1ul混匀后加样,进行1%琼脂糖凝胶电泳，同时加4ulDL2000 DNA Marker 作为PCR产物长度对照。电压100V, 30分后将胶板置于紫外灯下观察，Survivin和β-actin产物条带分别位于377bps和 495bps处。PCR产物条带的密度测定采用四星凝胶图像分析系统进行，以Survivin带亮度(Ls)、β-actin带亮度(Lβ)分别与背景亮度(Lb)的差值之比表示该Survivin的相对表达量,用公式表示为: Survivin的相对表达量=(Ls-Lb)/(Lβ- Lb)。

17. 2.免疫组化染色SP法 Survivin、CD34均需柠檬酸缓冲液高温修复。 免疫组化结果判断 ①肿瘤实质细胞中Survivin阳性反应定位于细胞质呈棕黄色。参照Kawaski[4]等采用半定量积分法判断结果: 阳性细胞数＜5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，＞75%为4分； 阳性强度淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。 两积分相乘，0分为阴性（-），1-4分为弱阳性（＋），5-8分为中等阳性（＋＋），9-12分为强阳性（＋＋＋）。

18. ②CD34：肿瘤间质血管内皮细胞标记物,阳性部位位于内皮细胞胞膜和胞浆。以CD34标记MV，MV呈棕黄色。②CD34：肿瘤间质血管内皮细胞标记物,阳性部位位于内皮细胞胞膜和胞浆。以CD34标记MV，MV呈棕黄色。 ③MVD观察与计数：以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分明显区别的任何一个棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇作为一个血管，只要结构不相连，其分枝结构也作为一个血管计数（管腔结构及内含红细胞并非计数所必须）。先在显微镜低倍视野（4×10倍）下选定高MVD处,再在高MVD5个高倍视野（20×10倍）下，计数MVD，取其平均值作为该标本的MVD。

19. ㈣病例随访情况 对30例有确切地址的2000年底前进行手术的星形细胞肿瘤患者术后进行随访，随访至2003年12月止，结果随访到26例，失访4例，随访率为86.67%（26/30）。随访结果显示星形细胞肿瘤患者术后生存时间为0-40个月不等。

20. ㈤统计学处理 两样本均数比较用t检验； 多组数值变量资料间比较用单因素方差分析； 率的比较用χ2检验 ； 等级资料的比较采用秩和检验,两样本比较采用Wilcoxon法，多个样本比较采用Kruskal-Wallis法,多个样本两两比较采用t检验； 对随访资料的分析采用Kaplan-Meier法,两组生存率的比较用Wilcoxon-Gehan检验，多组生存率的比较用log-rank检验。 检验水准α＝0.05。

21. 二、结果

22. ㈠RT-PCR检测Survivin基因mRNA的表达 1.总RNA的提取与检测 随机取3例进行变性胶电泳检测RNA的质量，结果见图1，28S、18S条带清晰可见，5S条带很弱，且28S条带亮度远远大于18S条带，说明提取的总RNA完整，没有降解。三条泳道条带亮度基本一致，说明RNA上样量基本相同。 图1 .RNA变性胶电泳

23. 2.RT-PCR检测Survivin基因的表达与肿瘤临床病理因素的关系2.RT-PCR检测Survivin基因的表达与肿瘤临床病理因素的关系 ⑴RT-PCR检测Survivin基因的表达 Survivin基因的RT-PCR产物为377个碱基， β-actin的RT-PCR产物为495个碱基。 26例脑星形细胞肿瘤中Survivin基因的表达见图2、3。

24. 495bps 377bps 495bps 377bps 图2、3，M：DL2000 DNA Marker ；N：正常脑组织；1-26为星形细胞肿瘤

25. 由图2、3显示，本组脑星形细胞 肿瘤中Survivin基因的阳性检出率 为65%（17/26），正常脑组织中 未检测到Survivin的表达。

26. ⑵Survivin基因表达与脑星形细胞肿瘤临床病理 特征的关系 不同病理分级的脑星形细胞肿瘤，Survivin基因表达的阳性率分别为：Ⅱ级66.67%（2/3），Ⅲ级85.71%（6/7），Ⅳ级56.25%（9/16），各病理级别间Survivin基因的表达无显著差异（P＞0.05）。 不同年龄的患者，Survivin基因表达的阳性率分别为：＞44岁66.67%（12/18），≤44岁62.5%（5/8），不同年龄组间Survivin基因的表达无显著差异（P＞0.05）。 不同性别的患者，Survivin基因表达的阳性率分别为：男性70%（14/20），女性50%（3/6），不同性别间Survivin基因表达无显著差异（P＞0.05）。

27. 3.Survivin基因相对表达量与脑星形细胞肿瘤临床病理因素的关系3.Survivin基因相对表达量与脑星形细胞肿瘤临床病理因素的关系 根据公式Survivin基因的相对表达量=(Ls-Lb)/(Lβ- Lb) 分别计算出各例的Survivin基因相对表达量，进一步 分析，本组有17例脑星形细胞肿瘤表达Survivin基因， Survivin基因相对表达均量为1.08±0.17。

28. Survivin基因相对表达量与脑星形细胞肿瘤病理分级的关系 病理分级 例数 Survivin相对表达量 P值 Ⅱ 2 0.855±0.007 Ⅲ 6 1.02±0.08P=0.0233 Ⅳ 9 1.171±0.175 在脑星形细胞肿瘤的不同病理级别间Survivin基因相对 表达量存在显著差异（P＜0.05）， 两两比较显示，Survivin基因相对表达量在Ⅱ级与Ⅳ级 间（P=0.039）存在显著差异，而在Ⅱ级与Ⅲ级间 （P=0.384）、Ⅲ级与Ⅳ级间（P=0.163）无显著差异。

29. ㈡免疫组化染色结果 1.Survivin蛋白在脑星形细胞肿瘤中的表达 2.脑星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与 MVD的关系 3.脑星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与 术后生存时间的关系

30. ⑴Survivin阳性染色均定位于肿瘤细胞的胞浆中，⑴Survivin阳性染色均定位于肿瘤细胞的胞浆中， 棕黄色颗粒状(见照片1、2、3)，阳性细胞呈弥漫或 局灶分布。 本组病例Survivin蛋白阳性表达率为57.14%（40/70）， 其中（+）为12例，（++）为19例，（+++）为9例。 5例相对正常脑组织中Survivin表达阴性。

31. Survivin阳性染色定位于肿瘤细胞的胞浆中， 呈棕黄色颗粒状（免疫组化SP法×500）

32. Survivin强阳性染色，肿瘤细胞的胞浆中可见 棕黄色颗粒（免疫组化SP法×500）

33. Survivin强阳性染色，肿瘤细胞的胞浆中可见 棕黄色颗粒（免疫组化SP法×500）

34. 不同病理分级、年龄、性别中Survivin蛋白的表达率不同病理分级、年龄、性别中Survivin蛋白的表达率 Ⅱ级阳性率为10%（1/10），Ⅲ级阳性率为53.85%（14/26），Ⅳ级阳性率为73.53%（25/34）。 青年组阳性率为45%（18/40），中老年组阳性率为73.33%（22/30）。 男性阳性率为60.42%（29/48），女性阳性率为50%（11/22）。 不同年龄组间、不同性别间Survivin表达无显著差异（分别进行Wilcoxon两样本比较法，均P＞0.05）。

35. Survivin蛋白在脑星形细胞肿瘤中的表达率

36. ⑵脑星形细胞肿瘤中不同病理分级间Survivin蛋白表达的比较⑵脑星形细胞肿瘤中不同病理分级间Survivin蛋白表达的比较 Survivin蛋白在脑星形细胞肿瘤中的表达 病理分级 例数 Survivin表达强度 H（u） P值 － ＋ ＋＋ ＋＋＋ Ⅱ 10 9 1 0 0 Ⅲ 26 12 4 6 4 10.43 P＜0.05 Ⅳ 34 9 7 13 5 不同级别的脑星形细胞肿瘤间，Survivin的表达有显著差别（Kruskal-Wallis法，P＜0.05）； 两两比较的秩和检验（t检验法）显示，脑星形细胞肿瘤Ⅱ级与Ⅲ级(t=2.45，P＜0.05)，Ⅱ级与Ⅳ级(t=3.45，P＜0.05)Survivin表达存在显著差异，而Ⅲ级与Ⅳ级间（t=1.27，P＞0.05）Survivin表达无显著差异。

37. ⑴CD34阳性反应物为棕黄色颗粒，分布在血管内皮⑴CD34阳性反应物为棕黄色颗粒，分布在血管内皮 细胞胞膜和胞浆(见照片4、5、6)。以CD34标记MV， MV呈棕黄色，并计算MVD。

38. CD34在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化SP法×150）CD34在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化SP法×150）

39. CD34在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化SP法×250）CD34在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化SP法×250）

40. CD34在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化SP法×500）CD34在脑星形细胞肿瘤中的表达（免疫组化SP法×500）

41. ⑵脑星形细胞肿瘤中MVD与Survivin蛋白表达强度的关系 脑星形细胞肿瘤中MVD与Survivin蛋白表达强度的关系 Survivin表达强度 例数 微血管密度（MVD） P值 ＋ 12 14.42±4.92 ＋＋ 19 18.74±3.30 P=0.0000 ＋＋＋ 9 25.31±4.81 (F=17.50) MVD在Survivin不同表达强度间存在显著差别(P＜0.05), Survivin（+）与Survivin（++）间（P=0.028）， Survivin（+）与Survivin（+++）间(P=0.000)， Survivin（++）与Survivin（+++）间(P=0.002)均存在显著差异 经Spearman等级相关分析显示，Survivin表达强度与MVD呈显著 正相关（rs=0.6682，P＜0.05）。

42. ⑴本组病例有术后随访结果26例，术后存活时间为0-40个月不等。⑴本组病例有术后随访结果26例，术后存活时间为0-40个月不等。 Survivin表达（－）组随访到12例，术后平均生存时间为17±9.8个月； Survivin表达阳性组术后平均生存时间为6.6±6.5个月，其中Survivin表达（+）组随访到4例，术后平均生存时间14.5±5.3个月， Survivin表达（++）组随访到5例，术后平均生存时间5.2±4.0个月， Survivin表达（+++）组随访到5例，术后平均生存时间为1.6±1.8个月。

43. 脑星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与术后生存时间的关系脑星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与术后生存时间的关系 Group1：Survivin(-)；Group2：Survivin(+)； Group3：Survivin(++)；Group4：Survivin(+++)

44. 经Log-rank时序检验，Survivin不同表达强度之间的生存率有显著差别（=24.55，P＜0.05）。经Log-rank时序检验，Survivin不同表达强度之间的生存率有显著差别（=24.55，P＜0.05）。 进一步两两比较，Survivin表达（－）组的生存率高于Survivin表达（++）组（P=0.0052）及Survivin表达（+++）组（P=0.0018）； Survivin表达（+）组的生存率高于Survivin表达（++）组（P=0.0143）及Survivin表达（+++）组（P=0.0139）； Survivin表达（－）组与Survivin表达（+）组的生存率无显著差异（P=0.7611），Survivin表达（++）组与Survivin表达（+++）组的生存率无显著差异（P=0.1693）。

45. ⑵分别统计Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级脑星形细胞肿瘤中Survivin阳性者与阴性者的术后生存时间。⑵分别统计Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级脑星形细胞肿瘤中Survivin阳性者与阴性者的术后生存时间。 Ⅱ级阳性者无随访资料，阴性者有1例随访资料，术后生存时间为24个月； Ⅲ级随访到14例，阳性者为7例，术后平均生存时间为9.7±6.6个月，阴性者为7例，术后平均生存时间为18.1±10.2个月； Ⅳ级随访到11例，阳性者为7例，术后平均生存时间为3.4±4.9个月，阴性者为4例，术后平均生存时间为13.2±10.3个月。

46. Ⅲ级星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与术后生存时间的关系Ⅲ级星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与术后生存时间的关系 Group1：Survivin(-)；Group2：Survivin(+)

47. Ⅳ级星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与术后生存时间的关系Ⅳ级星形细胞肿瘤Survivin蛋白的表达与术后生存时间的关系 Group1：Survivin(-)；Group2：Survivin(+)

48. 经Wilcoxon-Gehan检验显示， Ⅲ级中阴性者的生存率高于阳性者（P=0.0472）， Ⅳ级中阴性者的生存率也高于阳性者（P=0.0462）。

49. ㈢RT-PCR与免疫组化检测Survivin表达结果的比较 1.比较26例同时进行RT-PCR和免疫组化检测Survivin结果 RT-PCR和免疫组化检测结果的比较 免疫组化检测 RT-PCR检测 合计 + － + 13 3 16 － 4 6 10 合计17 9 26 进行配对检验,P=1.000，提示两种检测方法无显著差异。 进一步做相关分析，rn=0.4218，提示两种方法呈正相关。

50. 2.比较17例免疫组化Survivin不同表达强度与RT-PCR结果为阳性Survivin相对表达量的关系2.比较17例免疫组化Survivin不同表达强度与RT-PCR结果为阳性Survivin相对表达量的关系 Survivin基因相对表达量与免疫组化表达强度间的关系 免疫组化表达强度 例数 Survivin基因相对表达量 P值 － 4 0.91±0.09 + 3 1.02±0.07 P=0.0003 ++ 6 1.06±0.12 （F=13.44） +++ 4 1.32±0.06