第五章 氨基酸发酵机制及菌种的选育技术 第一节 谷氨酸发酵机制及生产菌的选育 一、谷氨酸发酵机制

1. 第五章 氨基酸发酵机制及菌种的选育技术 第一节 谷氨酸发酵机制及生产菌的选育 一、谷氨酸发酵机制 生物体内合成谷氨酸的前体物质是α-酮戊二酸，是三羧酸循环的中间产物，因此，由糖质原料生物合成谷氨酸的途径包括糖酵解途径、三羧酸循环、乙醛酸循环、CO2的固定反应等。 1. 谷氨酸生物合成途径 ① 由葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径 在谷氨酸发酵时，糖酵解经过EMP和HMP两个途径进行，生物素充足菌HMP所占比例约为38%，控制生物素亚适量的结果表明在发酵产酸期，EMP所占比例更大，约为74%。生成丙酮酸后，一部分氧化脱羧生成乙酰CoA，一部分固定CO2生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，在经过氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸，如图5-1所示。

2. ② 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径

3. 2. 谷氨酸生物合成的代谢调节机制 微生物的代谢途径主要有两种，即分解代谢和合成代谢。微生物通过分解代谢从环境中摄取营养物质，把它们转化为自身物质，以此来提供能源和小分子中间体；通过合成代谢将 分解代谢产生的能量和中间体合成氨基酸、核酸、蛋白质等物质。在工业上，通过对微生物代谢途径的控制，来满足生产的需要，提高生产效益。所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。

4. 3. 细胞膜通透性的调节 （1）控制细胞膜的形成 控制细胞膜形成的常用方法有： ① 利用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，限制发酵培养基中生物素的浓度。 ② 利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，添加表面活性剂或饱和脂肪酸。 ③ 利用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，限制发酵培养基油酸的浓度。 ④ 利用甘油缺陷型进行谷氨酸发酵，限制发酵培养基甘油的浓度。 （2） 控制细胞壁的形成 细胞壁的骨架结构是肽聚糖，因此，肽聚糖的合成及其调节控制就与细菌细胞膜的通透性密切相关。青霉素是转肽酶的抑制剂，它与转肽酶活性部位上的Ser残基形成了共价键，使转肽酶受到了不可逆的抑制。青霉素作为糖肽末端结构（D-Ala-D-Ala）的类似物，竞争性地抑制合成糖肽的底物，而与转肽酶的活性中心结合，使糖肽合成不能完成，结果形成不完整的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态，易于破损，增大谷氨酸的通透性。

5. 二、谷氨酸生产菌的选育 现在经过鉴定和命名的谷氨酸产生菌很多，其中主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属和节杆菌属中的细菌（如表5-1）。目前，我国企业使用的谷氨酸生产菌主要是北京棒杆菌AS 1.299、钝齿棒杆菌AS 1.542和天津短杆菌T6-13以及它们的各种突变株。1. 自然选育 这种方法有利于谷氨酸生产菌保持纯系良种，使谷氨酸生产具有相对稳定性，提高发酵水平。但是由于菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作用，使得自发突变率极低，导致选育耗时长、工作量大、效率低，一般不宜单独采用。2．诱变选育 诱变的目的是通过物理因素、化学因素及其它一些因素的单一或复合处理，使谷氨酸生产菌细胞内的遗传物质发生变化，通过分离筛选，可获得具有优良特性的变异菌株。物理因素主要有紫外线、Co60、X射线、γ-射线、快中子、α-射线、β-射线、超声波、He-Ne激光辐照、离子束等。化学因素主要有氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶等。3.杂交育种杂交育种包括常规杂交和原生质体融合技术，其中原生质体融合技术近年来发展较为活跃。4. 代谢控制选育 （1）选育耐高糖、高谷氨酸的菌株 （2）选育能强化谷氨酸合成代谢，削弱或阻断支路代谢的菌株 （3）选育能提高谷氨酸通透性的菌株5. 基因工程选育 随着生物工程新技术的发展，体外DNA重组的基因工程和固定化细胞技术都已应用于谷氨酸发酵研究。