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九十六年度教育部 「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」 基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表

九十六年度教育部 「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」 基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表. PART II. 主題： 細胞轉染技術與分析 運用流式細胞儀觀察細胞程式性死亡. 課程名稱 : 進階實驗課程 B— 細胞科技實驗              學分數 :1 學分 ( 實驗 ) 負責教師 : 黃昭祥、 楊堉麟 、葉怡玲                         授課時間 :96/08/04, 05, 11, 12 教室 : 尖端生物技術科技人才培育計畫實驗室. 基因表現產物之分析 SEAP: 實驗規劃. 96 well( 一 , 二組 ).

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九十六年度教育部 「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」 基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表

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  1. 九十六年度教育部「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表九十六年度教育部「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」基因體與蛋白質體醫學暑期學分班課程表 PART II • 主題： • 細胞轉染技術與分析 • 運用流式細胞儀觀察細胞程式性死亡 課程名稱: 進階實驗課程B—細胞科技實驗              學分數:1學分(實驗) 負責教師: 黃昭祥、楊堉麟、葉怡玲                         授課時間:96/08/04, 05, 11, 12 教室:尖端生物技術科技人才培育計畫實驗室

  2. 基因表現產物之分析SEAP:實驗規劃

  3. 96 well(一 , 二組)

  4. 96 well(三 , 四組)

  5. 96 well(五 , 六組)

  6. BMP-2基因產物誘導 SEAP基因表現 （本次實驗） BMP2 receptor Signal transduction 訊息誘導出的轉錄因子（蛋白質） BMP-2 基因 SEAP基因 pMyc-SEAP Myc element SEAP 分泌型鹼性磷酸酵素

  7. BMP-2基因產物誘導 SEAP基因表現 （本次實驗） BMP2 receptor Signal transduction 訊息誘導出的轉錄因子（蛋白質） BMP-2 基因 SEAP基因 pMyc-SEAP Myc element SEAP 分泌型鹼性磷酸酵素

  8. 實驗設計用意 • 探討BMP-2基因表現是否可以誘導特定轉錄因子表現。

  9. 轉殖基因表現的分析 SEAP DETECTION SYSTEM

  10. 原理簡介 WHY

  11. WHY 冷光 better than 螢光 ？ • LOW BACKGROUND: • HIGH S/N RATIO • HIGH SENSITIVITY (due to above reasons) • EVEN BETTER THAN ISOTOPE Gamma-ray X-ray 冷光 螢光 可見光 偵測波長決定偵測靈敏度 靈敏

  12. Gamma-ray X-ray 冷光 螢光 可見光 偵測波長決定偵測解析度 解析度 0.1mm mm 1nm 0.1nm FMS LMS EMS

  13. Pathway Profiling System Detection system • 一. 材料: • Assay Buffer , chemiluminescent enhancer , 5X Dilution Buffer , 25mM CSPD（冷光受質） • Positive control placental alkaline phosphatase • 二. 試驗前配置的working solution : • 1. 1X Dilution Buffer : 以Mini-Q water 將5X Dilution Buffer做1:5 稀釋 • 2. 1.25mM CSPD Substrate working solution : 將25mM CSPD chemiluminescent substrate與chemiluminescent enhancer做1:19稀釋

  14. 各重要成分介紹

  15. 三. 步驟: • 1. 將15ml sample加到96-well plates的每個well裡 • 2. 再加入45 ml的1X Dilution Buffer至每個sample well中，混合均勻 • 3. 將step 2的diluted sample 在65Oc的水浴漕裡，反應30分鐘 • 4. 反應30分鐘後，再將96-well plate 放在冰上2~3分鐘回溫 • 5. 再加入60ml 的Assay buffer 至每個sample well裡，反應5分鐘 • 6. 再加入60ml的diluted CSPD Substrate 至每個sample well中，反應10分鐘 • 7. 並在step6之後的30分鐘內，以x-ray方式壓片/洗片（定影, 顯影）

  16. 考 Whyheating 65’C

  17. 考 WhyAssay buffer Rx 5 ‘

  18. 結果分析

  19. 預期結果 （第一組為例） 結論？ 結論？ 結論？ 結論？ 結論？

  20. 預期結果 （第一組為例 BMP:1ug） （第二組為例 BMP:2ug ） （第三組為例 BMP:4ug ） 結論？

  21. 使用細胞 • NRK: NORMAL RAT KIDNEY (fibroblast cells) • MDCK: MADIN DARBY CANINE KIDNEY (tubule) • M13: MURINE MESANGIAL CELLS

  22. Apoptosis 組別實驗內容規劃 • NRK、NRK+植物萃取物A • NRK+植物萃取物B 、 NRK+H2O2 • NRK+pCMV-BMP2 • M13 、 M13 +BSA • MDCK、MDCK+Mannitol、MDCK+H2O2 • M13 +H2O2

  23. 步驟 • 首先將上清液移至15ml離心管。 • 加入1ml的PBS wash細胞，勿沖洗避免細胞剝落。 • 將上清液移至步驟1的離心管。 • 加入1ml的Tyrpsin在37℃反應5min。 • 加入3ml的PBS將細胞洗下並移到步驟1的離心管。 • 加入3ml的將細胞徹底洗下並移到步驟1的離心管。 • 使用2000 rpm離心細胞5min後，再以同轉數再離心1min。 • 倒去上清液，並可使用200μl的Tip吸乾殘餘的PBS，移入Flow管。 • 加入 100uL染劑, 於RT培養30分鐘, 持續震盪 • 加入200μl的Binding buffer並充分混合均勻。 • 上機分析，分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。 Read FL-1 (Annexin) and FL-2 (PI)

  24. 試劑置備與參數設定 • staining sol’n配製： • 32μl annexin V-FITC + 800 μL binding buffer + 32 μL Propidium iodine(PI) = 600μl • Flow cytometer設定參數 • P1 - FSC Lin • P2 - SSC Lin • P3 – FL-1 (Annexin-V) Log • P4 – FL-2 (PI) Log

  25. Detection of ROS

  26. Introduction 盡可能避光

  27. ROS DETECTION PRINCIPLE H2DCFDA 黃綠螢光 Intracellular Esterase Detect by Flow cytometer Oxidized by ROS

  28. 實驗步驟 1.刺激時間終了後 此盤刺激過的細胞不做任何變動 並加入約50uM/ml（1mM stock solution加100μl至各well）的H2DCF-DA在37℃反應30min。 2. 把上清的medium移到15ml離心管 。 3. 使用2ml PBS wash細胞然後把PBS移到步驟2的離心管。 4. 再加入2ml PBS並在室溫反應10min。 5. 將此PBS移到步驟2。 6. 加入0.5ml trypsin在37℃反應5 min。 7. 然後使用步驟2的離心管內的PBS+Medium的混合液沖洗細胞並移到步驟2。 8. 以2000 rpm 離心5min。 9. 倒去上清液,再加入2 ml PBS並mix細胞，使細胞打散。 10. 再以2000 rpm離心5min。 11. 倒去上清液,然後再加入1 ml Flow cytometer專用的PBS 並混 合均勻。 12. 將步驟11移動到Flow cytometer專用的試管 13.上機分析上機分析，分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。

  29. 實驗組別規劃 第1組 NRK CON+DCFH CON+DCFH CON 植物萃取物A+DCFH 植物萃取物A+DCFH 植物萃取物A+DCFH 植物萃取物A對纖維母細胞氧化壓力的影響

  30. 第2組 NRK CON+DCFH CON+DCFH CON 植物萃取物B+DCFH 植物萃取物B+DCFH 植物萃取物B+DCFH 植物萃取物B對纖維母細胞氧化壓力的影響

  31. 第3組 NRK CON+DCFH CON+DCFH CON pCMV-BMP2 +DCFH pCMV-BMP2 +DCFH pCMV-BMP2 +DCFH BMP-2基因表現對纖維母細胞氧化壓力的影響

  32. 第4組(只做上面一排) M13 CON+DCFH BSA+DCFH CON H2O2 H2O2+DCFH BSA+DCFH H2O2與白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響

  33. 第5組 MDCK CON CON+DCFH Mannitol+ DCFH CON Mannitol+ DCFH CON+DCFH 高滲透壓對遠端腎小管細胞氧化壓力的影響

  34. 第6組(只做下面一排) M13 CON+DCFH BSA+DCFH CON H2O2 H2O2+DCFH BSA+DCFH 高H2O2或白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響

  35. 預期結果 (增加ROS) (不增加ROS) Control DCFH Treatment +DCFH

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