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COLORATIONS EN BACTERIOLOGIE Pr KOFFI Stéphane
INTRODUCTION Les colorations en Bactériologie permettent l’étude qualitative des bactéries Elles s’effectuent après la réalisation d’un frottis La coloration des frottis a pour but de rendre plus facilement perceptibles cytologiques qui échappent lors de l’examen à l’état frais. les détails
OBJECTIFS 1. Définir les termes: coloration différentielle, coloration simple 2. Citer 4 colorations utilisées en bactériologie 3. Décrire les étapes de la coloration de Gram 4. Décrire les résultats de la coloration de Gram
COLORATIONS SIMPLES DEFINITION • C’est une coloration qui utilise un seul colorant basique • Tous les éléments ont la même couleur • Ex: coloration au bleu de méthylène
COLORATION AU BLEU DE METHYLENE • Frottis fin, traité par un seul colorant basique • Technique est simple et rapide • Peu courante, à l’exception de l’examen du pus urétral pour la Gonocoque (diplocoque en grain de café intracellulaire). recherche de
COLORATIONS DIFFERENTIELLES DEFINITION • C’est une coloration qui utilise au moins deux colorants basiques • Les éléments prennent des couleurs différentes selon leurs caractéristiques • Ex: coloration de Gram
COLORATION DE GRAM C’est une coloration différentielle basée sur les différences structurales et la perméabilité plus grande de la paroi des bactéries Gram négatif à l’alcool Elle a été découverte par Hans GRAM en 1884 et permet de distinguer : • Bactéries colorées en violet : Gram positif • Bactéries colorées en rose : Gram négatif.
COLORATION DE GRAM Principe • 1ertemps : Réaliser un complexe colorant soluble (violet de Gentiane-lugol) qui colore en violet le cytoplasme de toutes les bactéries • 2èmetemps : Réaliser une décoloration par l’alcool – Bactéries Gram négatif : paroi laisse passer l’alcool – Bactéries Gram positif : paroi ne se laisse pas traverser • 3èmetemps : Réaliser une contre-coloration par la fuchsine – Bactéries Gram négatif fixent le 2èmecolorant et apparaissent rouge – Bactéries Gram positif conservent la coloration violette du 1er temps.
COLORATION DE GRAM • Réactifs –Alcool à 95° –Violet de gentiane : 1ercolorant –Lugol : un mordant –Fuchsine : 2èmecolorant.
COLORATION DE GRAM • Etapes de la coloration de GRAM – Réaliser le frottis, laisser sécher à l’air libre avant de le fixer à l’alcool – Couvrir la lame du violet de gentiane pendant 1 mn et laver à l’eau propre – Couvrir la lame de Lugol pendant 30 secondes et laver – Décolorer à l’alcool et laver – Couvrir la lame de fuchsine pendant 30 secondes – Laver, sécher et observer la préparation à l’immersion (Objectif X100).
COLORATION DE GRAM Matériel et réactifs: 1.Frottis séché et fixé 2.Kit Gram : Crystal violet ou violet de gentiane, lugol, éthanol, fuchsine ou safranine
COLORATION DE GRAM • Résultats de la coloration de GRAM –Bactéries Gram négatif sont en rose ou rouge. –Bactéries Gram positif apparaissent en bleu. Cette technique permet de voir : –la forme des bactéries –leur mode de regroupement –les éléments associés (polynucléaires, levures…).
COLORATION DE GRAM Causes d’erreurs Causes des faux positifs – Frottis fixé avant d’être sec – Frottis trop épais – Dépôt de colorant dans le flacon de violet – Solution de Lugol mal préparée – Action trop brève de l’alcool – Solution de fuchsine trop forte.
COLORATION DE GRAM Causes d’erreurs Causes des faux négatifs – Solution de Lugol laissée trop peu de temps – Alcool laissé trop longtemps et/ou insuffisamment rincé.
COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN • Les bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) compte tenu de la composition de leur paroi sont détectés spécifiquement. • Il s’agit du groupe des mycobactéries dont le bacille tuberculeux (bacille de Koch ou BK) colorées en rouge sur un fond bleu. • Ce recherche plus facile sur un frottis. contraste de coloration permet une
COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN • Réactifs – Alcool (méthanol pur) – Fuchsine qui est le 1ercolorant – Acide nitrique – Alcool éthylique à 90° – Bleu de Méthylène.
COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN • Etapes de la coloration • Etaler le produit pathologique et sécher • Fixer au méthanol pur • Recouvrir la lame de la fuchsine pendant 10 mn • chauffer par passage d’une flamme dans le dos de la lame, • Répéter l’opération trois fois en 10 mn (ne pas faire bouillir) • Laver à l’eau propre jusqu’à ce que l’eau devienne claire • Plonger la lame dans la solution acide nitrique au 1/3 pendant 45 sec, puis laver • Plonger dans l’alcool à 90° pendant 5 mn, puis laver • Tremper la lame dans le contre-colorant (bleu de Méthylène) pendant 2 mn, laver, sécher et observer à l’immersion.
COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN • Résultats • Les BAAR apparaissent comme des petits bâtonnets rouges sur un fond bleu du frottis. Bacilles Acido-Alcoolo-Résistants (B.A.A.R.) après coloration de Ziehl-Neelsen
COLORATION DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA (MGG) • Elle est à visée cytologique pour une meilleure individualisation des (polynucléaires, macrophages, lymphocytes…) • Les bactéries peuvent observées avec leur capsule. éléments cellulaires être néanmoins • Exemple : le pneumocoque (Streptococcus pneumoniae).
TECHNIQUE D’IMPREGNATION ARGENTINE • Intérêt dans : –l’angiomatose bacillaire ou la maladie des griffes du chat –la recherche de Treponema pallidum (Spirochète).
• Coloration de Moeller –Permet la visualisation de la spore (genre Clostridium) • Coloration de Leifson –Permet la visualisation des cils ou flagelles (Vibrio) • Coloration par anticorps marqués par un conjugué fluorescent –Limité à la recherche de Legionella pneumophila dans les prélèvements pulmonaires.
