1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL INFORME DE LABORATORIO: “AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DEL POTENCIAL AMILOLÍTICO DE CEPAS NATIVAS DEL VALLE EL ALGARROBAL - ILO PARA LA OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ENZIMÁTICOS ” CURSO: MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL DOCENTE: Dr. HEBERT HERNAN, SOTO GONZALES PRESENTADO POR: LINARES BEJARANO, BRITTANY ANTUANET PINO CATARI, CLAUDIA KAROL CICLO: VII ILO - PERÚ

2. RESUMEN.................................................................................................................................3RESUMEN.................................................................................................................................3 1. INTRODUCCIÓN................................................................................................................. 4 2. OBJETIVOS...........................................................................................................................5 2.1. Objetivo General...........................................................................................................5 2.2. Objetivos Específicos....................................................................................................5 3. HIPÓTESIS............................................................................................................................5 3.1. Hipótesis General..........................................................................................................5 3.2. Hipótesis Específicas.....................................................................................................5 4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...............................................................................6 5. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS.........................................................................7 5.1. Materiales de laboratorio..............................................................................................7 5.2. Equipos..........................................................................................................................7 5.3. Reactivos y medios de cultivo.......................................................................................7 5.4. Materiales de campo......................................................................................................8 6. METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL..............................................8 7. RESULTADOS.....................................................................................................................27 8. CONCLUSIONES............................................................................................................... 29 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................31 10. ANEXOS............................................................................................................................31 2 | Página

3. RESUMEN El presente estudio se desarrolló en el Valle El Algarrobal – Ilo, Moquegua, con el propósito de aislar y evaluar bacterias nativas con capacidad amilolítica, es decir, productoras de enzimas que degradan almidón en azúcares simples. Se recolectaron muestras de suelo en tres puntos georreferenciados y se procesaron mediante diluciones seriadas, siembra en medio selectivo TSA suplementado con almidón al 1% e incubación. La actividad enzimática se reveló con lugol, observándose halos de hidrólisis alrededor de colonias positivas. Posteriormente, se purificaron los cultivos mediante estrías sucesivas y se caracterizaron morfológicamente con tinción de Gram, identificándose diversidad bacteriana: cocos Gram positivos (predominantes), bacilos Gram positivos y bacilos Gram negativos. Las pruebas bioquímicas (TSI, Citrato, MIO) y la prueba de catalasa permitieron diferenciar perfiles metabólicos preliminares, destacando los bacilos Gram positivos por su reacción catalasa positiva y metabolismo aerobio, favorable para procesos industriales. Finalmente, la evaluación específica en agar con almidón confirmó la actividad amilolítica en las tres cepas seleccionadas, validando su potencial para la obtención de extractos enzimáticos. Estos resultados evidencian que el Valle El Algarrobal constituye una fuente prometedora de biodiversidad microbiana con aplicaciones biotecnológicas en sectores como alimentos, biocombustibles y detergentes, sentando bases para futuras investigaciones. 3 | Página

4. 1. INTRODUCCIÓN El Valle El Algarrobal en Ilo, Moquegua, representa un ecosistema único con características edafológicas particulares que favorecen el desarrollo de una microbiota diversa. Los microorganismos presentes en suelos y sedimentos de esta región pueden poseer capacidades metabólicas especiales, entre ellas la producción de enzimas amilolíticas, las cuales catalizan la hidrólisis del almidón en azúcares más simples. Las enzimas amilolíticas, principalmente α-amilasas, β-amilasas y glucoamilasas, tienen gran importancia en diversos sectores industriales como la producción de jarabes de glucosa, panificación, detergentes, textiles y biocombustibles. La búsqueda de nuevas fuentes de estas enzimas a partir de microorganismos nativos representa una alternativa biotecnológica sostenible que puede contribuir al desarrollo de procesos industriales más eficientes y económicos. La exploración de la biodiversidad microbiana local no solo permite identificar cepas con potencial biotecnológico, sino que también contribuye al conocimiento de los recursos biológicos de la región de Moquegua. El aislamiento y caracterización de bacterias amilolíticas nativas puede conducir al desarrollo de bioproductos con aplicaciones industriales, generando valor agregado a partir de recursos locales. El presente estudio se enfoca en el aislamiento de bacterias amilolíticas del Valle El Algarrobal, su caracterización preliminar mediante técnicas microbiológicas convencionales y la evaluación de su potencial para la producción de extractos enzimáticos con actividad amilolítica. 4 | Página

5. 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo General Aislar y evaluar el potencial amilolítico de cepas bacterianas nativas del Valle El Algarrobal - Ilo para la obtención de extractos enzimáticos con posibles aplicaciones biotecnológicas. 2.2. Objetivos Específicos A. Aislar bacterias amilolíticas a partir de muestras de suelo/sedimento del Valle El Algarrobal mediante técnicas de cultivo en medio selectivo con almidón como única fuente de carbono complejo. B. Purificar los cultivos bacterianos mediante técnicas de aislamiento por agotamiento en estrías para obtener colonias puras y morfológicamente homogéneas. C. Caracterizar morfológicamente las colonias bacterianas aisladas mediante observación macroscópica de características coloniales y tinción diferencial de Gram para clasificación preliminar. D. Realizar pruebas bioquímicas preliminares (TSI, Citrato, MIO) para la identificación taxonómica tentativa de las cepas con mayor potencial amilolítico. 3. HIPÓTESIS 3.1. Hipótesis General Existen bacterias nativas en el suelo del Valle El Algarrobal - Ilo con capacidad de producir enzimas amilolíticas que pueden ser aisladas y utilizadas para la obtención de extractos enzimáticos. 3.2. Hipótesis Específicas A. Las muestras de suelo/sedimento del Valle El Algarrobal contienen bacterias con actividad amilolítica detectable mediante cultivo en medio con almidón. 5 | Página

6. B. Las bacterias amilolíticas aisladas presentan características morfológicas y tintoriales diversas que permiten su diferenciación y clasificación preliminar. C. La actividad amilolítica de las cepas puede evidenciarse mediante la formación de halos de hidrólisis alrededor de las colonias tras la aplicación de lugol. D. Las cepas aisladas corresponden a diferentes grupos bacterianos identificables mediante pruebas bioquímicas convencionales. 4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La creciente demanda de enzimas amilolíticas en la industria requiere la búsqueda de fuentes alternativas de producción que sean económicamente viables y ambientalmente sostenibles. Actualmente, muchas enzimas utilizadas industrialmente provienen de microorganismos no nativos o son producidas mediante procesos costosos. El Valle El Algarrobal en Ilo representa un ecosistema poco explorado desde el punto de vista microbiológico, y su diversidad microbiana podría albergar cepas bacterianas con capacidades enzimáticas de interés biotecnológico. Sin embargo, existe un desconocimiento sobre el potencial amilolítico de los microorganismos presentes en esta zona. Pregunta de investigación: ¿Existen bacterias amilolíticas en el suelo del Valle El Algarrobal - Ilo que puedan ser aisladas, caracterizadas y utilizadas para la obtención de extractos enzimáticos? La identificación y caracterización de estas bacterias nativas podría: ● Contribuir al conocimiento de la biodiversidad microbiana local ● Proporcionar nuevas fuentes de enzimas amilolíticas ● Generar alternativas biotecnológicas para aplicaciones industriales ● Valorizar los recursos biológicos de la región de Moquegua 6 | Página

7. 5. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 5.1. Materiales de laboratorio ● Placas Petri estériles ● Tubos de ensayo con tapa rosca ● Tubos de ensayo estándar ● Pipetas de 100 μL ● Asa de Digralsky ● Asa de siembra bacteriológica ● Cucharas estériles para muestreo ● Portaobjetos y cubreobjetos ● Mechero Bunsen ● Gradillas 5.2. Equipos ● Autoclave ● Incubadora bacteriológica ● Microscopio óptico ● Balanza analítica ● Vortex o agitador ● Refrigerador 5.3. Reactivos y medios de cultivo ● Agar Tripticasa Soya (TSA) ● Almidón soluble (1%) ● Agua destilada estéril ● Lugol ● Kit de tinción de Gram (cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, safranina) 7 | Página

8. ● Agar TSI (Triple Sugar Iron) ● Agar Citrato de Simmons ● Medio MIO (Movilidad-Indol-Ornitina) ● Caldo nutritivo ● Agar nutritivo 5.4. Materiales de campo ● Contenedores estériles para muestras ● Etiquetas identificadoras ● Guantes ● GPS 6. METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Toma de muestras Se realizó la colecta de muestras de suelo en tres puntos diferentes del Valle El Algarrobal, Ilo, Moquegua. Cada punto de muestreo fue debidamente georeferenciado y las muestras fueron almacenadas en contenedores estériles hasta su procesamiento en laboratorio. Figura 1. Punto 1: Muestra 1 8 | Página

9. Nota. Fotografía propia Figura 2. Punto 2: Muestra 2 Nota. Fotografía propia Figura 3. Punto 3: Muestra 3 Nota. Fotografía propia 2. Preparación de materiales y medios de cultivo Esterilización de materiales: 9 | Página

10. Todo el material fue esterilizado en autoclave (cucharillas, tubos de ensayo con agua y asas digralsky) y en estufa (placas petri). 10 | Página

11. Figura 4. Esterilización en autoclave Nota. Fotografía propia Figura 5.Esterilización en estufa Nota. Fotografía propia Preparación del medio TSA + Almidón 1%: 1) Se realizaron los cálculos correspondientes para la cantidad necesaria de medio 2) Se pesaron los reactivos: Agar Tripticasa Soya y almidón soluble 3) Se añadió agua destilada según especificaciones 4) Se mezcló homogéneamente 5) Se esterilizó en autoclave 6) Se vertió el medio estéril en placas Petri estériles bajo condiciones asépticas 11 | Página

12. Figura 6. Preparación del medio de cultivo Nota. Fotografía propia Preparación de tubos con agua destilada: Se dispensaron 9 mL de agua destilada estéril en tubos de ensayo para las diluciones seriadas 3. Procesamiento de muestras y siembra Homogeneización y diluciones seriadas: 1) Se homogeneizó cada muestra de suelo con agua destilada estéril 2) Se prepararon diluciones seriadas (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³.) para cada muestra 3) Se agitó vigorosamente cada dilución para asegurar la dispersión de los microorganismos Figura 7. Procesamiento de muestras 12 | Página

13. Nota. Fotografía propia Siembra por dispersión: 1) Se tomaron 100 μL de cada dilución con pipeta estéril 2) Se dispensó el inóculo sobre la superficie del medio TSA + Almidón 1% 3) Se dispersó uniformemente con asa de Digralsky estéril 4) Se realizó por triplicado para cada dilución Figura 8. Siembra uniforme de las muestras Nota. Fotografía propia Incubación: Las placas sembradas se incubaron a temperatura óptima (30-37°C) durante 24-48 horas (Se monitorea el crecimiento bacteriano). 13 | Página

14. Figura 9. Placas petri en la incubadora Nota. Fotografía propia 4. Revelado de actividad amilolítica Prueba con Lugol: 1) Después del período de incubación, se agregó solución de lugol sobre las colonias desarrolladas 2) Se observó la formación de halos claros (sin coloración) alrededor de las colonias amilolíticas 3) El medio con almidón no hidrolizado se tiñó de color azul-púrpura por acción del lugol 4) Se seleccionaron las colonias con mayor zona de hidrólisis (halo más grande) Figura 10. Placas con lugol para comprobar el crecimiento de amilasa Nota. Fotografía propia 14 | Página

15. 5. Aislamiento y purificación de colonias Siembra por agotamiento (técnica de estría): 1) Se seleccionaron las colonias con actividad amilolítica más evidente 2) Utilizando asa de siembra estéril, se realizó la técnica de agotamiento por estrías en placas nuevas con TSA + Almidón 1% 3) Se incubó nuevamente durante 24 horas 4) Este proceso se repitió hasta obtener cultivos puros Figura 11.Primera siembra por agotamiento Nota. Fotografía propia Segundo agotamiento: 1) Se realizó un segundo agotamiento tomando las últimas estrías del cultivo anterior 2) Se seleccionaron 2 colonias representativas por cada una de las 3 muestras (total: 6 colonias) 3) Las colonias seleccionadas se sembraron individualmente 15 | Página

16. Figura 12. Segunda siembra por agotamiento, a partir de la primera Nota. Fotografía propia 6. Caracterización morfológica - Primera tinción de Gram Preparación del frotis: 1) Se prepararon frotis a partir de las 3 muestras purificadas 2) Se realizó disolución de cada muestra con agua destilada estéril sobre portaobjetos 3) Se fijó con calor suave Figura 13. Tinción de Gram Nota. Fotografía propia 16 | Página

17. Tinción de Gram: 1) Aplicación de cristal violeta (1 minuto) 2) Aplicación de lugol (1 minuto) 3) Decoloración con alcohol-acetona (segundos) 4) Coloración de contraste con safranina (30-60 segundos) 5) Lavado con agua entre cada paso Figura 14. Tinción de Gram Nota. Fotografía propia Observación microscópica: Resultados: Las tres muestras presentaron bacilos Gram positivos Figura 15. Resultado de la muestra 01 Nota. Fotografía propia 17 | Página

18. Figura 16. Resultado de la muestra 02 Nota. Fotografía propia Figura 17. Resultado de la muestra 03 Nota. Fotografía propia 7. Siembra en tubos de ensayo 1) Las 2 colonias seleccionadas de cada muestra fueron sembradas en tubos de ensayo con tapa rosca conteniendo medio de cultivo adecuado 2) Se inoculó mediante técnica aséptica 3) Se incubó a temperatura óptima durante 24 horas 4) Total de tubos inoculados: 6 (2 por cada muestra) 18 | Página

19. Figura 18. Siembra por estría en los tubos de ensayo. Nota. Fotografía propia 8. Segunda caracterización - Tinción de Gram post-incubación Preparación de frotis: 1) Se prepararon frotis a partir de los 6 tubos incubados (numerados del 1 al 6) 2) Se realizó disolución de 5 muestras con agua destilada estéril Observación: En la muestra 6 no hubo crecimiento bacteriano Tinción de Gram: Se aplicó el protocolo estándar de tinción de Gram en las 5 muestras con crecimiento Observación microscópica: Figura 19. Muestra 1: Cocos Gram positivos Nota. Fotografía propia 19 | Página

20. Figura 20. Muestra 2: Bacilos Gram Negativos Nota. Fotografía propia Figura 21.Muestra 3: Bacilos Gram positivos Nota. Fotografía propia Figura 22. Muestra 4: Cocos Gram positivos Nota. Fotografía propia 20 | Página

21. Figura 23. Muestra 5: Cocos Gram Positivos Nota. Fotografía propia 9. Selección de cepas para pruebas bioquímicas De los 5 cultivos con crecimiento, se seleccionaron 3 muestras representativas que mostraron diferentes características morfológicas y tintoriales: ● Una muestra con cocos Gram positivos ● Una muestra con bacilos Gram negativos ● Una muestra con bacilos Gram positivos Figura 24.Muestras seleccionadas para las pruebas bioquímicas Nota. Fotografía propia 10. Preparación de medios para pruebas bioquímicas Se prepararon los siguientes medios de cultivo para la caracterización bioquímica: 21 | Página

22. Medios en tubos: 1) TSI (Triple Sugar Iron): 0.98 g - para determinar fermentación de azúcares y producción de H₂S Figura 25. TSI Nota. Fotografía propia 2) Citrato de Simmons: 0.34 g - para evaluar utilización de citrato como única fuente de carbono Figura 26. Citrato Nota. Fotografía propia 3) MIO (Movilidad-Indol-Ornitina): 0.47 g - para determinar movilidad, producción de indol y descarboxilación de ornitina 22 | Página

23. Figura 27. MIO Nota. Fotografía propia 4) Caldo nutritivo: 0.48 g - para crecimiento y mantenimiento de cultivos Figura 28. Caldo Nutritivo Nota. Fotografía propia Figura 29. Preparación de medios para las pruebas bioquímicas Nota. Fotografía propia 23 | Página

24. Medio en placas: Agar nutritivo: 2.16 g - para cultivo en placa y resiembra 11. Inoculación de medios 1) TSI: Se realizó un pinchazo profundo en el agar hasta el fondo del tubo y luego una estría en la superficie inclinada con asa de siembra. Figura 30. Resultados de la prueba de TSI Nota. Fotografía propia 2) Citrato: Se realizó únicamente estría en la superficie del medio inclinado. Figura 31. Resultados de la prueba de Citrato Nota. Fotografía propia 3) MIO: Se realizó un pinchazo profundo en el centro del medio. 24 | Página

25. Figura 32. Resultados de la prueba de MIO Nota. Fotografía propia 4) Caldo nutritivo: Se inoculó la muestra directamente en el caldo. Figura 33. Resultados de la prueba de Caldo Nutritivo Nota. Fotografía propia Todos los tubos inoculados se incubaron a 37°C durante 24 horas. 12. Prueba de Catalasa Se realizó la prueba de catalasa colocando una pequeña cantidad de cultivo bacteriano en un portaobjetos limpio y agregando una gota de agua oxigenada (H₂O₂) al 3%. Se observó la formación inmediata de burbujas (producción de oxígeno) como indicador de actividad catalasa positiva. Solo los bacilos Gram positivos mostraron reacción positiva (formación de burbujas), indicando la presencia de la enzima catalasa. 25 | Página

26. Figura 34. Resultados de la prueba de Catalasa Nota. Fotografía propia 13. Evaluación de actividad amilolítica en agar Se prepararon placas de agar nutritivo con almidón al 1%. Se realizó un orificio en el centro de cada placa con un asa estéril. Se inoculó cada muestra en el orificio correspondiente y se incubaron las placas a 37°C durante 24 horas. Tras la incubación, se retiró el medio del orificio y se cubrió la superficie de la placa con reactivo de Lugol. Se midió el diámetro del halo claro de hidrólisis alrededor del punto de inoculación, indicativo de actividad amilolítica. Figura 35. Resultados de la evaluación de la actividad amilolítica Nota. Fotografía propia 26 | Página

27. 7. RESULTADOS 1. Aislamiento Bacteriano Se logró el aislamiento exitoso de bacterias de las tres muestras de suelo/sedimento recolectadas del Valle El Algarrobal. Las diluciones seriadas permiten obtener concentraciones adecuadas de microorganismos para su siembra e incubación. 2. Detección de actividad Amilolítica primaria Tras la aplicación de lugol sobre las placas de TSA + almidón al 1%, se observaron halos de hidrólisis claros alrededor de varias colonias bacterianas, confirmando la presencia de actividad amilolítica. Las colonias con halos más prominentes fueron seleccionadas para su posterior caracterización. 3. Obtención de cultivos puros Mediante técnicas sucesivas de agotamiento por estría, se obtuvieron cultivos bacterianos puros a partir de las colonias seleccionadas. De las 6 colonias sembradas inicialmente en tubos, 5 presentaron crecimiento viable para análisis posteriores. 4. Caracterización morfológica Primera caracterización: Las tres muestras iniciales presentaron morfología de bacilos Gram positivos. Segunda caracterización (5 muestras viables): Muestra 1: Cocos Gram positivos Muestra 2: Bacilos Gram negativos Muestra 3: Bacilos Gram positivos Muestra 4: Cocos Gram positivos Muestra 5: Cocos Gram positivos 27 | Página

28. Estos resultados demuestran diversidad morfológica en las bacterias aisladas, con predominancia de cocos Gram positivos (3/5) y presencia de bacilos tanto Gram positivos como Gram negativos. 5. Pruebas bioquímicas Bacilos Gram positivos: 1) TSI: (A/A) 2) Citrato: Negativo (-) 3) MIO: Motilidad (-), Indol (-), Ornitina (-) 4) Catalasa: Positivo (+) Bacilos Gram negativos: 1) TSI: (A/A) 2) Citrato: Negativo (-) 3) MIO: Motilidad (+), Indol (-), Ornitina (-) 4) Catalasa: Negativo (-) Cocos Gram positivos: 1) TSI: (A/A) 2) Citrato: Negativo (-) 3) MIO: Motilidad (+), Indol (-), Ornitina (-) 4) Catalasa: Negativo (-) Estos perfiles bioquímicos permiten la diferenciación preliminar de las cepas aisladas y sugieren la presencia de diferentes géneros bacterianos. 6. Actividad amilolítica específica En las placas de agar nutritivo con almidón, tras la aplicación de lugol, se observaron halos de hidrólisis de diferentes tamaños alrededor de los puntos de inoculación. Las 28 | Página

29. tres cepas seleccionadas mostraron actividad amilolítica positiva, confirmando su capacidad para producir enzimas que degradan el almidón. La cepa de bacilos Gram positivos mostró la reacción de catalasa más intensa, lo que sugiere un metabolismo aerobio activo, característica favorable para procesos de producción enzimática a escala industrial. 8. CONCLUSIONES ● Se logró aislar exitosamente bacterias con actividad amilolítica a partir de muestras de suelo/sedimento del Valle El Algarrobal - Ilo, confirmando la presencia de microorganismos con potencial biotecnológico en esta zona. ● El medio de cultivo TSA suplementado con almidón al 1% demostró ser efectivo para el aislamiento selectivo de bacterias amilolíticas, permitiendo la visualización de halos de hidrólisis mediante la prueba de lugol. ● Se identificó diversidad morfológica entre las cepas aisladas, incluyendo cocos Gram positivos (predominantes), bacilos Gram positivos y bacilos Gram negativos, lo que sugiere variedad de géneros bacterianos en el ecosistema estudiado. ● Las pruebas bioquímicas (TSI, Citrato, MIO) permitieron la caracterización preliminar de tres cepas representativas, evidenciando perfiles metabólicos diferenciados que facilitarán su identificación taxonómica futura. ● La prueba de catalasa positiva en los bacilos Gram positivos indica un metabolismo aerobio, característica ventajosa para procesos industriales de producción enzimática que requieren condiciones de aerobiosis. ● Las tres cepas seleccionadas (cocos Gram positivos, bacilos Gram negativos y bacilos Gram positivos) demostraron actividad amilolítica confirmada mediante la formación de halos de hidrólisis en agar con almidón, validando su potencial para la obtención de extractos enzimáticos. ● Los resultados obtenidos constituyen una base sólida para futuras investigaciones orientadas a la optimización de la producción de amilasas, 29 | Página

30. caracterización enzimática detallada y evaluación de aplicaciones industriales específicas de estas cepas nativas. ● El Valle El Algarrobal representa una fuente prometedora de biodiversidad microbiana con potencial biotecnológico, justificando estudios más exhaustivos sobre sus recursos microbiológicos. 30 | Página

31. 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Gutiérrez-Rojas, I., Moreno-Sarmiento, N., & Montoya, D. (2015). Mecanismos y regulación de la hidrólisis enzimática de almidón en el proceso de obtención de jarabes de glucosa. Revista Colombiana de Biotecnología, 17(2), 5-21. https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v17n2.50856 Hernández-Guzmán, A., Navarro-Díaz, H. J., Nuñez-Palenius, H. G., Ochoa-Fuentes, Y. M., & Vázquez-Ovando, A. (2014). Caracterización bioquímica de AmiJ33, una amilasa de Bacillus amyloliquefaciens aislada de suelos cultivados con caña de azúcar en la región del Papaloapan. Revista Mexicana de Ingeniería Química, 13(2), 281-296. https://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2007-0705201400020 0003 Quintero, J. C., Lú-Chau, T. A., Moreira, M. T., Feijoo, G., & Lema, J. M. (2006). Perspectiva en el desarrollo de las enzimas industriales a partir de la inteligencia tecnológica. Revista Universidad EAFIT, 42(143), 87-101. http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-560920060002000 07 Sánchez, C., Mejía, C., Figueroa, C., & Esquivia, M. (2005). Estudio de cepas nativas amilolíticas. Vitae, Revista de la Facultad de Química Farmacéutica, 12(2), 21-28. http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0121-400420050002000 03 31 | Página