A-Ingeniería de S. cerevisiae para Detección de Dulzor (1)

1. Curso: Biotecnologia • Docente: Blgo. Hebert Soto Gonzales • Integrantes: INGENIERÍA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE PARA DETECTAR DULZOR • Nelva Rodriguez Mejia • Aaron Gutierrez Velarde • Yhon Alexander Ramos Ccallata • Salomon F. Jinez Mamani • Elgar Quincho Ramos "PROPUESTA DE BIOSENSOR EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA"

2. Los edulcorantes son fundamentales en la industria alimentaria, con un mercado global millonario. Actualmente, la evaluación de dulzura depende de métodos costosos y complicados, como el uso de células HEK293 con receptores de dulzor humanos. Sin embargo, este sistema presenta limitaciones, como el largo tiempo de cultivo y requisitos específicos de condiciones. En este estudio, se propone una alternativa basada en Saccharomyces cerevisiae, una levadura segura y de fácil cultivo, modificada genéticamente para detectar dulzor al expresar los receptores de dulzor humanos T1R2/T1R3, abriendo nuevas posibilidades para explorar edulcorantes de forma más eficiente. • Introducción

3. Determinar la viabilidad de S. cerevisiae como biosensor de dulzura mediante modificaciones genéticas. • Expresar el receptor T1R2/T1R3 en levadura. • Optimizar la vía MAPK para amplificar señales. • Validar la sensibilidad a diferentes edulcorantes. • Objetivo General • Objetivos Específicos

4. metodologia • Eliminación de los genes Sst2, Far1 y Ste2 para amplificar la señalización MAPK. • Modificación de la proteína Gpa1 de S. cerevisiae para que pueda interactuar con T1R2/T1R3. • Expresión heteróloga de T1R2/T1R3 con secuencias señal modificadas, creando la cepa D3Gm.

5. Modificación de la vía MAPK en S. cerevisiae Expresión heteróloga del receptor de dulzor humano T1R2/T1R3 Objetivo: Mejorar la capacidad de señalización de la vía MAPK para permitir la detección de dulzor. Procedimiento: Se eliminaron los genes Sst2, Far1 y Ste2. Estos genes están involucrados en la regulación negativa de la señalización de la vía MAPK, por lo que su eliminación amplifica la respuesta de señalización en la célula. Objetivo: Equipar a S. cerevisiae con la capacidad de detectar moléculas dulces de manera similar al sistema sensorial humano. Procedimiento: Se introdujeron los genes que codifican los receptores T1R2 y T1R3 en S. cerevisiae modificada. Para asegurar una expresión efectiva de los receptores, se utilizaron péptidos señal N-terminales, que son secuencias que facilitan el transporte y la correcta localización de las proteínas en la célula. Modificación de la proteína Gpa1 Creación de la cepa D3Gm Proceso final: Se creó una cepa de S. cerevisiae llamada D3Gm que incorpora todas las modificaciones mencionadas. Esta cepa se diseñó para detectar edulcorantes mediante la activación de la vía MAPK en respuesta a la interacción de los receptores T1R2/T1R3 con las moléculas dulces. Objetivo: Permitir que la proteína Gpa1 de S. cerevisiae interactúe con los receptores de dulzor humanos T1R2/T1R3. Procedimiento: El extremo C de la proteína Gpa1 fue reemplazado por los cinco residuos de la proteína convertidora del gusto humano. Esta modificación asegura que Gpa1 pueda transmitir la señal de interacción del receptor de dulzor al sistema de señalización de la levadura.

6. Rastros de fluorescencia de mT1R2-mRFP y mT1R3-eGFP observados con un microscopio láser de barrido confocal. Izquierda: micrografías de fluorescencia; derecha: micrografías fusionadas de canales de fluorescencia y canales TD. • permiten estudiar la localización intracelular de proteínas fusionadas con etiquetas fluorescentes (GFP o mRFP). • el uso de diferentes colores (verde y rojo) facilita estudiar la co-localización o diferencias en la distribución de las proteínas. • estos resultados son relevantes para entender procesos celulares específicos, como señalización o interacciones proteína-proteína.

7. La cepa D3Gm mostró capacidad de detección de los edulcorantes acesulfamo K y neotamo. • Se observó un aumento significativo en la señal fluorescente de D3Gm en presencia de estos edulcorantes. • La detección fue posible en un rango de concentraciones de 0.25 a 2.5 g/L. • Resultados y Discusión es la levadura Saccharomyces cerevisiae modificada genéticamente por los investigadores para que pueda detectar edulcorantes

8. 1 Eliminación de los genes Sst2, Far1 y Ste2 para amplificar la señalización de la vía MAPK: • Sst2 realiza una regulación negativa de retroalimentación en la vía MAPK, por lo que se eliminó para evitar esta inhibición. • Far1 detiene el ciclo celular en la fase G1, lo que podría causar estancamiento del crecimiento celular, por lo que también se eliminó. • Ste2 es el receptor de feromonas en la vía MAPK, y se eliminó para evitar interferencias en la señalización. • 2 Modificación de la proteína Gpa1 de S. cerevisiae: • Se reemplazaron los cinco residuos del extremo C-terminal de Gpa1 con los cinco residuos de la proteína G gustducina humana. • Esto permitió que Gpa1 interactuara con el receptor del sabor dulce humano T1R2/T1R3. • 3 Expresión heteróloga de T1R2/T1R3 modificado: • Se reemplazaron los péptidos señal de T1R2 y T1R3 con el péptido funcional N-terminal de Ste2 para mejorar la expresión. • Se generó así la cepa D3Gm, que contenía el heterodímero híbrido mT1R2/mT1R3.

9. Conclusiones • Esta investigación demuestra que es posible utilizar S. cerevisiae para detectar dulzor. • El sistema podría aplicarse en la industria para evaluar nuevos edulcorantes y mejorar la sensibilidad y especificidad en futuros estudios. • Primera demostración exitosa de detección de dulzor en S. cerevisiae • Prueba de concepto validada • Base para futuros desarrollos • Potencial significativo para industria alimentaria

10. ¡MUCHAS GRACIAS • Universidad Borcelle