L’intolleranza al glutine

1. L’intolleranza al glutine Alberto Tommasini, Laboratorio Immunologia Pediatrica, IRCCS Burlo Garofolo tommasini@burlo.trieste.it

2. Samuel Gee, 1888

3. Che cosa è la celiachia Enteropatia da causa alimentare Malassorbimento Difetto di crescita Possibili concause infettive Crisi celiaca

4. Quali alimenti ? Enteropatia da causa alimentare Trattamento dietetico:dall’inizio del ‘900 diete ipersemplificate 1908 Herter: I grassi sono tollerati meglio dei carboidrati 1924 Haas: Dieta povera in carboidrati ad eccezione di quelli contenuti nelle banane (che consentono di tollerare bene I grassi). - anni ‘30: esclusione di tutti i farinacei - anni ‘40: solo i derivati del frumento

5. Quale parte del frumento ? Intolleranza al glutine Glue = colla + glutine + intrappolamento di aria durante la lievitazione

6. Dove si trova il glutine ? frumento orzo avena farro segale

7. alimenti privi di glutine Dove non si trova il glutine ? Alimenti privi di glutine , Mais, Legumi www.farmacialoreto.it/

8. Enteropatia Effetto tossico del glutine sui villi intestinali Atrofia dei villi Villi normali (enorme superficie di assorbimento)

10. Malassorbimento 200 anni Intestino tenue Tratto prossimale ferro, calcio, lipidi vitamine idrosolubili Digiuno carboidrati e aminoacidi Tratto distale acidi bilari e vitamina B12 Determinante è l’azione del colon per l’assorbimento di acqua ed elettroliti

11. Malassorbimento Alimenti privi di glutine • Mancanza di nutrienti: • dimagrimento, distrofia, difetto di crescita • Mancanza di vitamine e microelementi • anemia sideropenica • osteopenia /osteoporosi • Passaggio di cibo non digerito nel colon • Metabolismo batterico, meteorismo • presenza di grasso nelle feci

12. La diagnosi Con glutine Senza glutine Con glutine

13. Valutati gli effetti di peptidi sintetici sintetici di gliadina in diversi modelli in vitro (intestino di pollo, fegato di ratto). Peptide candidato: residui 75-86 dell’ a-gliadina RPQQPYPQPQPQ Studi di tossicità Produzione di INF-g da sangue di celiaco stimolato con I singoli peptidi Infusione intraduodenale dei petidi in soggetti celiaci

14. L’85 % dei celiaci ha l’HLA DQ2, il 10% il DQ8: Associazione di linkage o ruolo patogenetico dell’HLA? HLA e CELIACHIA b1 0201 a1 0501

15. peptide HLA e glutine

16. Biopsia di soggetti celiaci in GFD • incubate per 18 h con digesto peptico-triptico di gliadina • isolamento di cellule CD25+ e allestimento di linee e cloni T • misura della risposta proliferativa specifica al glutine • inibizione dell’attivazione con anticorpi anti-specifici HLA • T riconoscono il glutine in maniera ristretta dal DQ2 Cloni T, HLA, glutine

17. Cause e meccanismi risposta immune: infezione da glutine Anticorpi anti-glutine (AGA) Linfociti T anti glutine produttori di INFgamma Risposta simile a quella verso un agente infettivo continuamente somministrato

18. Risposta al glutine ed enteropatia

19. Tetrameri costruiti in baculovirus con peptide covalentemente legato • coniugati con strepatvidina R-PE • peptidi a-1 a-2 e g-1 Tetrameri HLA e T DQ2 anti gliadina Streptavidina-RPE Peptide HLA

20. ANALISI CITOMETRICA SU SANGUE PERIFERICO CON TETRAMERI-PE CON PEPTIDE g-1-DQ a-1-DQ 2 a-2-DQ Tetramero-PE Tetrameri HLA come monoclonali Limiti: la colorazione diminuisce fortemente dopo stimolo specifico, a causa di una downregolazione del TCR

21. Quanto è frequente Rara 1:1000/ 1:10000 Quadro clinico: ben caratterizzato; enteropatia glutine-dipendente Patogenesi: non compresa Diagnosi: lungo iter; 3 biopsie “Celiachia” Prevenzione: ritardare l’introduzione del glutine.

22. LA nuova celiachia IL PRESENTE Non sempre l’enteropatia è evidente • Anemia isolata • Osteopenia isolata • Altre manifestazioni più “distanti” • Dermatite erpetiforme • Malattie autoimmuni (diabete, tiroidite …)

23. Cause e meccanismi Dagli EMA all’autoimmunità Dagli anni ’80 l’associazione con malattie autoimmuni aveva spinto alla ricerca di marcatori autoimmuni • Gli anticorpi anti endomisio (EMA) • Capire la patogenesi dell’autoimmunità celiaca ? • Migliorare la diagnostica sierologica della malattia ! • Qual è l’auto-antigene responsabile ?

24. Cause e meccanismi La transglutaminasi tessutale • Come ci si è arrivati • - Un enzima importante Che c’entra con il glutine e la celiachia?

25. Cause e meccanismi Ruolo della transglutaminasi JEM 2000

26. Che cosa c’entra la’utoimmunità? • Gli Ac anti endomisio • epifenomeno? • trascinamento? • patogenetici?

27. Il modello celiachia Alterata immunità - ambiente

28. Il modello celiachia Alterata immunità - ambiente

29. Quanto è frequente IL PRESENTE Frequente 1:100/1:250 (testing, screening) Quadro clinico: polimorfo; enteropatia NON necessaria silente/latente/potenziale G.I. = “casi atipici” Patogenesi: alterata risposta immune geneticamente determinata. Diagnosi: semplificata; autoanticorpi (EMA, htTG) 1 (o NO?) biopsia. “Genetic gluten Intolerance” Prevenzione: glutine “tanto e subito” Screening di massa?

30. Ambiente e rischio di diabete Quanto pesa l’ambiente ? Ci sono fattori ambientali identificabili ? Come interagiscono con l’individuo ? E’ possibile operare una prevenzione ?

31. Fattori ambientali ipotizzati: Infezioni da enterovirus (Carratù ‘99, Hiltunen ‘97) Latte vaccino (Kolb ‘99) Glutine (SIGEP ‘99)

32. Il latte vaccino e l’uomo • Uomo nomade e cacciatore • Non alleva vacche • A volte ottiene latte da capre • 1600: allevamenti di vacche da latte • breve tempo • per selezione negativa

33. Infiammazione glutine dipendente della mucosa intestinale e rischio di diabete 7% 6,2% 6% 4,7% 5% 3,5% 4% 3% 2% 0,8% 1% 0% Celiaci 2-10 <2 >10

34. Infiammazione: aumento di linfociti nella mucosa L’ intestino nel diabete Permeabilità della mucosa intestinale

35. Il modello celiachia C-DNA scFv Ag scFv Tag gene3 scFv VH VK CH1 VH CK VK Ciclo fagico VH VK Antigene C-DNA Lavaggio Studio con librerie anticorpali • Amplificare l’mRNA che codifica le regioni • variabili delle Ig. • 2) Clonare i c-DNA • in vettori fagici. • 3) Selezione dei fagi • che riconoscono • la tTG.

36. Il modello celiachia Studio con librerie anticorpali • Gli anti TTG nel celiaco sono prodotti solo e soltanto dai linfociti della mucosa intestinale(Marzari et al. J. Immunol, 2001). • “Epitope mapping” ovvero esiste una specificita’ epitopica degli anti TTG nel celiaco (Sblattero D. et al J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001 ). • Anche altri autoanticorpi, quando presenti nel celiaco, sono prodotti dai linfociti della mucosa intestinale( Boscolo S. et al, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001). • La produzione di autoanticorpi da parte dei linfociti intestinali prescinde dalla presenza e dalla gravita’ della lesione istologica e puo’ NON essere rilevabile nel siero(Sblattero D. et al J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001 ).

37. Il modello celiachia PBL library Epitope mapping Atassia da glutine IBL library

38. Come si può curare DALLA CONOSCENZA DEI PEPTIDI TOSSICI A NUOVE TERAPIE • - Induzione di tolleranza • peptidasi batteriche • riso transgenico?

39. Come si può curare Peptidasi Il peptide tossico di 33 aa, che viene deaminato dalla transglutaminasi e riconosciuto dall’HLA DQ2, potrebbe essere specificamente scisso da peptidasi batteriche che potrebbero essere utilizzate per pretrattare il cibo

40. Come si può curare Peptidasi Digestione inefficace dei peptidi tossici da parte degli enzimi del brush border intestinale Efficace completamento della Digestione con Prolyl endopeptidasi batterica

41. Come si può curare Riso transgenico STRATEGIE ADOTTATE PER “DETOSSIFICARE” IL FRUMENTO • Breeding e selezione di linee di frumento a basso contenuto in gliadine • Modificazioni per eliminare le sequenze antigeniche PROBLEMATICHE • Elevato numero di geni distribuiti su 42 cromosomi • Elevata variabilità genetica • Diffusione di varietà coltivate

42. Come si può curare Utilizzare un cereale non allergenico Oryza sativa Riso transgenico STRATEGIA Migliorare le proprietà tecnologiche introducendo le sequenze gluteniniche con le migliori caratteristiche reologiche

44. Che cosa è la celiachia Perché tanto glutine 200 anni 30% Glutine 2% DQ2/DQ8 Infezioni