Proteomics
Download
1 / 36

Proteomics - PowerPoint PPT Presentation


  • 236 Views
  • Uploaded on

Proteomics . ΕΠΛ 450. Proteomics. Ανάλυση συνόλου πρωτεΐνης οργανισμού Δύο κατηγορίες: 1. Expression proteomics : Διαχωρισμός, μέτρηση, χαρακτηρισμός μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών Αυτό γίνεται κυρίως με 2D-gel electrophoresis και mass spectrometry

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Proteomics ' - zwi


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
Proteomics

Proteomics

ΕΠΛ 450


Proteomics1
Proteomics

  • Ανάλυση συνόλου πρωτεΐνης οργανισμού

  • Δύο κατηγορίες:

  • 1. Expression proteomics: Διαχωρισμός, μέτρηση, χαρακτηρισμός μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών

  • Αυτό γίνεταικυρίως με 2D-gel electrophoresis και mass spectrometry

  • Υπάρχουν και μεθόδοι με protein chip arrays

  • Expressionproteomics καταγράφουν τις πρωτεΐνες που εκφράζονται σε ένα τύπο κυττάρων ή ιστού


Proteomics2
Proteomics

  • 2. Cellmapproteomics

  • Ανάλυση και χαρακτηρισμός της διάδρασης των πρωτεϊνών

  • Η αναγνώριση της θέσης των πρωτεϊνών και ποιες πρωτεΐνες δημιουργούν συμπλέγματα στο χώρο βοηθά στην

  • εύρεση της λειτουργίας

  • αναπαράσταση μονοπατιών κυττάρων

  • αναπαράσταση του δικτύου στα κύτταρα


Βιοπληροφορική

  • Χρειάζεται για την ανάλυση και μετάφραση των δεδομένων από πειράματα proteomics

  • Δημιουργία βάσεων δεδομένων

  • Αλγόριθμοι και στατιστικά tests

  • Imaging δεδομένων

  • Σύγκριση αποτελεσμάτων από μεθόδους 2D-gel και χρήση massspectrometry δεδομένων για αναζήτηση σε βάσεις δεδομένων


Proteome
Proteome

  • Ολόκληρη η ποσότητα πρωτεΐνης σε ένα οργανισμό ονομάζεται proteome

  • Εκατοντάδες χιλιάδες πρωτεΐνες

  • Αντιστοιχία με το γονιδίωμα (genome)

  • Proteome είναι πιο πολύπλοκο από το γονιδίωμα

  • Κάθε γονίδιο μπορεί να πράξει πολλά διαφορετικά mRNAs( διακοπή σε διαφορετικά σημεία, διαφορετική χρήση promoters)

  • Κάθε mRNA μπορεί να δώσει διαφορετική πρωτεΐνη


Proteome1
Proteome

  • Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μπορεί να τροποποιηθούν με πολλούς διαφορετικούς τρόπους

  • posttranslationalmodifications

  • Πολλές περισσότερες πρωτεΐνες από τα γονίδια

  • Το σύνολο των πρωτεϊνών σε ένα κύτταρο εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου και το περιβάλλον του

  • Όλα τα κύτταρα έχουν ένα σύνολο βασικών πρωτεϊνών που είναι απαραίτητες για επιβίωση

  • και ένα σύνολο από πρωτεΐνες με εξειδικευμένες λειτουργίες


Proteome2
Γιατί μελετάμε το proteome

  • Οι πρωτεΐνες και όχι το mRNA εκτελούν τις λειτουργίες του γονιδίου

  • Ακόμα και αν έχουμε διαθέσιμο όλο το γονιδίωμα του οργανισμού πολύ λίγες πληροφορίες μπορούμε να έχουμε για τις πρωτεΐνες που δημιουργούνται

  • Δεν ξέρουμε πως οι πρωτεΐνες αντιδρούν μεταξύ τους, πως τις επεξεργάζεται το κύτταρο

  • Για να καταλάβουμε τη λειτουργία τους πρέπει να μελετήσουμε απευθείας τις πρωτεΐνες


Proteome3
Πως γίνεται η μελέτη του proteome

  • Δύο κατηγορίες μελέτης

  • Expressionproteomics

  • Αναγνώριση των πρωτεϊνών στο proteome του οργανισμού

  • Εφαρμογές: εύρεση περιοχών ασθενειων, drugtargets

  • Cellmapproteomics

  • protein-proteininteractions


Proteomics3
Τεχνολογικές πλατφόρμες proteomics

  • Toproteome στα κύτταρα περιέχει χιλιάδες πρωτεΐνες που διαφέρουν σε περιεκτικότητα

  • Απαραίτητες διαδικασίες είναι:

  • Διαχωρισμός των πρωτεϊνών που αποτελούν το μείγμα - Τεχνολογίες διαχωρισμού πρωτεϊνών

  • Χαρακτηρισμός των πρωτεϊνών που αποτελούν το μείγμα - Τεχνολογίες χαρακτηρισμού πρωτεϊνών


Τεχνολογίες διαχωρισμού πρωτεινών

  • Διαχωρισμός πρωτεϊνών στο μείγμα σε ξεχωριστές πρωτεΐνες

  • Κάθε πρωτεΐνη βρίσκεται με διαφορετική περιεκτικότητα στο μείγμα

  • Διαχωρισμός βάση περιεκτικότητας που πρέπει να είναι ευαίσθητος να βρίσκει και πρωτείνες που έχουν πολύ χαμηλή περιεκτικότητα σε σχέση με τις άλλες στο κύτταρο


2d gel electrophoresis
2D-gel electrophoresis πρωτεινών

  • Τεχνολογία από το 1975

  • Το μείγμα πρωτεϊνών τοποθετείται πάνω σε ένα gel και χωρίζεται με isoelectricfocusing στην πρώτη του διάσταση βάσει φόρτισης

  • Οι πρωτεΐνες μεταναστεύουν σε ένα σημείο όπου δεν είναι πλέον φορτισμένες και χαμηλώνει το ph τους

  • Οι πρωτεΐνες χωρίζονται περαιτέρω στη δεύτερη διάσταση ανάλογα με τη μοριακή τους μάζα, βάσει μεγέθους

  • Το gel μετά διαβάζεται και οι πρωτεΐνες αποκαλύπτονται σαν patterns από τελείες


Περιορισμοί πρωτεινών

  • Αν και είναι η πιο διαδεδομένη μέθοδος έχει προβλήματα στην παρουσίαση των αποτελεσμάτων, την ευαισθησία και την αναπαραγωγή του πειράματος

  • Σε ένα πείραμα δεν μπορούμε να χωρίσουμε όλες τις πρωτεΐνες

  • Τελείες στο σχήμα μπορεί να αποτελούν μικρότερο μείγμα πρωτεϊνών κι όχι πρωτεΐνες ατομικές

  • Τα πειράματα δεν μπορούν αν επαναληφθούν για να γίνει σύγκριση μεταξύ διαφορετικών συνθηκών πειράματος


Εφαρμογές πληροφορικής πρωτεινών

  • Δημιουργία βάσης δεδομένων για αυτά τα δεδομένα

  • Ανάλυση εικόνας για αναγνώριση μέτρηση των spots

  • Σύγκριση plots για αναγνώριση ίδιων spots

  • Διασύνδεση των δεδομένων αυτών με άλλες πηγές δεδομένων


Τεχνολογίες χαρακτηρισμού πρωτεινών

  • Αν και ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών γινόταν από το 1975 η επόμενη διαδικασία, του χαρακτηρισμού των πρωτεϊνών δεν ήταν εφικτή

  • Δεν υπήρχαν μέθοδοι για να χαρακτηρίσουν τις πρωτεΐνες στα 2D gels

  • Υπήρχαν πολύ λίγες ακολουθίες πρωτεϊνών στις βάσεις δεδομένων για σύγκριση

  • Το πρόβλημα με τις βάσεις δεδομένων λύθηκε τα τελευταία 20 χρόνια με τα sequencingprojects

  • Η πιο διαδεδομένη τεχνική για χαρακτηρισμό πρωτεϊνών είναι η τεχνική massspectrometry


Mass spectrometry
Mass spectrometry πρωτεινών

  • Μέτρηση μοριακού φάσματος

  • Βασική Ιδέα: αναγνώριση μορίων βάσει μετρήσεων ακριβείας του ratio της μάζας/ φόρτισης τους

  • (m/z) ratio.

  • 1. Τοποθετείται το μόριο στη συσκευή μέτρησης

  • 2. Το μόριο φορτίζεται

  • 3. Καταγράφεται η επιτάχυνση του σε ένα μαγνητικό πεδίο

  • 4. Υπολογίζεται το πηλίκο, m/z ratio, και αναγνωρίζεται το μόριο


Ass spectrometry
Μ πρωτεινώνass Spectrometry

  • Καταμετρούνται οι μάζες των μορίων ενός δείγματος

  • Οι πιο διαδεδομένες διαδικασίες είναι:

  • Peptide mass fingerprinting (PMF)

  • Fragment ion Searching

  • DE novo sequencing of peptide ladders


Peptide mass fingerprinting
Peptide mass fingerprinting πρωτεινών

  • Επιτυχημένη διαδικασία σε δείγματα με πρωτεΐνες που έχουν περίπου την ίδια περιεκτικότητα

  • Ανάλυση ατομικών spots από την διαδικασία 2D-gel

  • Το δείγμα πρωτεΐνης πρώτα συνδυάζεται με το ένζυμο trypsin δημιουργώντας trypsicpeptides

  • Τα νέα πεπτίδια αναλύονται και οι μάζες του κάθε πεπτιδίου δίνεται με ακρίβεια

  • Τα αποτελέσματα χρησιμοποιούνται σαν query σε πρωτεϊνικές βάσεις δεδομένων όπως SWISSPROT

  • Αν μια πρωτεΐνη ανήκει στη βάση δεδομένων γίνεται η αναγνώριση της βάσει του συνδυασμού των πρωτεϊνών με την trypsin


Κύρια σημεία για τη μέθοδο πρωτεινών

  • Παίρνει γνωστές πρωτεΐνες, τις διασπά και τοποθετεί κομμάτια που παρατηρούνται συχνά στις βάσεις δεδομένων ώστε να μπορούν να αναγνωριστούν με αναζητήσεις στο μέλλον

  • Φτιάχνει τις άγνωστες πρωτεΐνες ως εξής:

  • Τις κόβει με ένζυμα (trypsin) και συγκρίνει τα κομμάτια με βάση δεδομένων

  • Υπολογίζει στην συνέχεια από τη βάση δεδομένων την ακολουθία που θα μπορούσε να δημιουργήσει εκείνα τα κομμάτια που παρατηρήθηκαν


Εφαρμογές πληροφορικής πρωτεινών

  • Διαχείριση των δεδομένων των πειραμάτων

  • Δημιουργία databases για ανακάλυψη κομματιών (fragmentidentification - databaselookup)

  • Δημιουργία αλγορίθμων για την επαναδημιουργία της ακολουθίας βάσει των κομματιών που υπάρχουν

  • Assemblyofproteinsbasedonpeptidefragments)

  • • Συγχώνευση με άλλες πηγές δεδομένων


Προβλήματα μεθόδου πρωτεινών

  • Δεν μπορούν να αναγνωριστούν όλες οι πρωτεΐνες γιατί η μέθοδος βασίζεται στην διαθεσιμότητα ολόκληρης της ακολουθίας της πρωτεΐνης σε βάσεις δεδομένων

  • Η μέθοδος είναι επιτυχημένη για γονιδιώματα που ολόκληρη η ακολουθία είναι γνωστή και υπάρχουν περιορισμένα posttranslationalmodification

  • Στο ανθρώπινο γονιδίωμα έχουμε πάρα πολλές αλλαγές στις πρωτεΐνες μετά την μετάφραση

  • Δυσκολεύει τη διαδικασία


Προβλήματα μεθόδου πρωτεινών

  • SNPs

  • Στο ανθρώπινο γονιδίωμα 1 SNP κάθε kilobase

  • Θα υπάρχουν 3,000,000 διαφορές σε βάσεις ανάμεσα σε δύο ανθρώπους

  • Τα SNPs βρίσκονται πιο πολύ σε noncodingregions, αλλά υπάρχουν και σε codingregions

  • Αν και πολλά που βρίσκονται σε codingregions δίνουν synonymouschanges

  • υπάρχουν 50000 πολυμορφισμοί αμινοξέων σε ένα ανθρώπινο γονιδίωμα

  • Οι ακολουθίες που διαφέρουν σε SNP θα διαφέρουν και σε μάζα

  • Δεν θα τις βρίσκουμε στη βάση δεδομένων


Protein chips
Protein chips πρωτεινών

  • Μικροσκοπικές συσκευές στις οποίες τοποθετούνται πρωτεΐνες ή άλλες ουσίες που δεσμεύουν πρωτεΐνες

  • Χρησιμοποιούνται για να διαχωρίσουν πρωτείνες

  • και για να τις χαρακτηρίσουν

  • Για ανακάλυψη νέων πρωτεϊνών-denovoproteinannotation- η τεχνολογία αυτή συνδυάζεται με τη μέθοδο massspectrometry


Protein chips1
Πλεονεκτήματα πρωτεινώνprotein chips

  • Μικρό μέγεθος

  • Ευκολία δημιουργία πειράματος

  • Με ένα πείραμα υπάρχουν πολλά δεδομένα όπως και με DNA arrays που έχουμε δει

  • Παρόμοια με DNA arrays χρειάζονται μέθοδοι για

  • ανάλυση εικόνας

  • μέτρησηsignal και normalization

  • σύγκριση διαφόρων θέσεων spots

  • κατηγοριοποίηση - clustering


Protein chips2
Είδη πρωτεινώνprotein chips

  • Antibodychips

  • Αντισώματα τοποθετούνται πάνω στο γυαλί και χρησιμοποιούνται για να ανιχνευθούν και να μετρηθούν συγκεκριμένες πρωτεΐνες σε ένα μείγμα

  • Antigenchips

  • Το αντίστροφο των chips με αντισώματα. Πρωτεΐνες βρίσκονται πάνω στο γυαλί και χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση και μέτρηση αντισωμάτων μέσα σε ένα δείγμα


Protein chips3
Είδη πρωτεινώνprotein chips

  • Universal protein arrays

  • Συσκευές που περιέχουν οποιαδήποτε πρωτείνη στο γυαλί και χρησιμεύουν στην ανίχνευση άλλων ή στην εύρεση διάδρασης πρωτεϊνών μεταξύ τους. Η ανίχνευση γίνεται με labeling των πρωτεϊνών ή με ανίχνευση αλλαγών στην επιφάνεια του γυαλιού

  • Proteincapturechips

  • Δεν περιέχουν πρωτεΐνες αλλά μόρια που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες με στόχο την απλοποίηση των πρωτεϊνικών μειγμάτων


Expression proteomics
Εφαρμογές πρωτεινώνexpression proteomics

  • Διάγνωση καρκίνου από expression των πρωτεϊνών

  • Αναγνώριση περιοχών ασθένειας με χρήση MS δεδομένων από ασθενή και υγιή δείγματα

  • Φαρμακευτική βιομηχανία

  • Μέτρηση τοξικότητας φαρμάκων

  • Ποιες είναι οι παρενέργειες ενός φαρμάκου σε κυτταρικό επίπεδο


Cell map proteomics
Εφαρμογές πρωτεινώνcell map proteomics

  • Για την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών θεωρείται δεδομένο ότι οι πρωτεΐνες σπάνια δουλεύουν μόνες αλλά είναι μέρη μιας μεγαλύτερης ομάδας

  • Οι ομάδες μπορεί να αποτελούνται από πολλές πρωτεΐνες ή από πρωτεΐνες και άλλες ουσίες

  • Μας ενδιαφέρει η εύρεση του τρόπου σύνδεσης και αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών στο κύτταρο


Protein interaction
Μεθόδοι πρωτεινώνprotein interaction

  • Η ανακάλυψη πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν γίνεται με:

  • γενετικές μεθόδους (supressormutations)

  • βιοχημικές μεθόδους (cross-linkingmethods)

  • κύτταρο βιολογικές μεθόδους (fluorescenceresonanceenergytransfer)

  • ατομικές μεθόδους (X-ray crystallography, NuclearMagneticResonance)


Protein interaction1
Μεθόδοι πρωτεινώνprotein interaction

  • Με συνδυασμό MS δεδομένων ανακαλύφθηκαν διάφορα proteincomplexes

  • Από αυτά, βρέθηκαν κάποιες ομάδες πρωτεϊνών που εμφανίζονται συχνά μαζί

  • Αυτές συνδέονται μεταξύ τους

  • Μας δίνονται στοιχεία για το δίκτυο στο κύτταρο

  • Υπάρχουν και ορθόλογαcomplexes ανάμεσα σε δυο οργανισμούς, έχουν την ίδια λειτουργία


Γράφοι πρωτεινών

  • Πληροφορίες για τον τρόπο που συνδέονται οι πρωτεΐνες απεικονίζονται συνήθως με γράφους

  • Οι ακμές είναι οι φυσικές συνδέσεις μεταξύ τους

  • Χρειάζονται μέθοδοι πληροφορικής για να παρουσιαστεί η πολυπλοκότητα των γράφων αυτών

  • Ενσωμάτωση των πληροφοριών αυτών στις βάσεις δεδομένων


Sxhma
Sxhma πρωτεινών


ad