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Iván Palomo

Universidad de Talca Facultad de Ciencias de la Salud Depto.de Bioquímica Clínica e Inmunohematología. LMC. Iván Palomo. SMP Leucemia Mieloide Crónica (LMC) Mielofibrosis con metaplasia mieloide Policitemia Vera

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  1. Universidad de TalcaFacultad de Ciencias de la Salud Depto.de Bioquímica Clínica e Inmunohematología LMC Iván Palomo

  2. SMP • Leucemia Mieloide Crónica (LMC) • Mielofibrosis con metaplasia mieloide • Policitemia Vera • Trombocitemia esencial

  3. Enf. Hematológicas malignas Incidencia Leucemia Incidencia (/100.000) Todas 6–10 LMC 1–2 LLC 2–3 LMA 2–3 LLA 1–2

  4. LMC • EPIDEMIOLOGíA • 15-20% de las leucemias (adultos) • 3-5% " " (niños) • 25-50 años (promedio 40) • 10 años más jóvenes que LLC

  5. LMC • CARACTERÍSTICAS GENERALES • Desorden clonal de una célula troncal • Crom. Philadelphia (Ph) se encuentra en granulocitos, • megacariocitos, monocitos y cél. eritroides. • Gran aumento del pool granulocítico • Enfermedad bifásica • Fase crónica • Fase acelerada • Fase aguda (Crisis blástica)

  6. LMC • ETIOLOGÍA • 5% causa conocida • Radiaciones • Agentes químicos • Benzol y derivados • Solventes • Insecticidas

  7. LMC Enf. con alteración molecular única LMC • Enf. proliferativa de stem cells hematopoyéticas • Curso clínico característico Cromosoma de Philadelphia (Ph) Alteración cromosómica única Tirosina kinasa Bcr-Abl • Alteración molecular única • Causa transformación de una Stem cells hematopoyética en clon maligno

  8. LMC Crom. Philadelphia (Ph) y gen bcr-abl Chromosome 22 Chromosome 9 9 q+ c-bcr 1 2-11 9 c-abl 22 2-11 p210Bcr-Abl Ph (or 22q-) 2-11 bcr p185Bcr-Abl bcr-abl Exons Introns CML Breakpoints ALL Breakpoints abl Proteína de fusión Actividad Tirosina Kinasa Translocación recíproca t(9;22) (q34;q11) bcr-abl gene structure

  9. Proteínas normales Bcr y Abl y sus contrapartes post-translocación

  10. Actividad tirosina kinasa de la proteína Abl • Tirosinas kinasas -Fosforilan tirosina -Actividad controlada en dominio N-terminal. • En región C-terminal dominio une a DNA y a los filamentos de actina (regular ciclo celular)

  11. Funciones de la proteína Bcr • Serina-treonina kinasa. • Tiene homología a proteínas G. • Puede participar en reparación del DNA.

  12. P Bcr-Abl Cytoskeletalproteins P SHC DOK GRB-2 CRKL RAS-GAP CRK CBL SOS PI3K P ? P STAT1+5 RAS-GDP RAS-GTP P SAPK RAF-1 P AKT P MEK1/2 P ERK MYC P BAD BAD 14-3-3 BCLXL BCLXL 14-3-3 Mitochondria Nucleus bcr-abl: Transducción de señales TYROSINE KINASE ACTIVITY

  13. Proliferación Apoposis Adhesión (alteración)

  14. Cromosoma Ph Prevalencia en Leucemias LMC 95 LLA Adulto 15–30 Niños 5 LMA 2

  15. Curso clínico: Fases de la LMC(pre-Imatinib) Advanced phases Chronic phase Median duration 5–6 years Accelerated phase Median duration6–9 months Blast crisis Median survival3–6 months

  16. Normal Normal LMC Fase Crónica CLÍNICA Síntomas Inespecíficos y graduales: Astenia, fatiga, cefalea, pérdida de peso, anorexia Signos Esplenomegalia (80%) Hepatomegalia (20%)

  17. LMC • Laboratorio • Hemograma • Estudio citogenético • Cariograma • Fish • RT-PRC bcr-abl • FAN • Citometría de flujo

  18. Laboratorio: Parámetros típicos(según fase) Parameter Chronic Accelerated Blast Crisis WBC count 20 x 109/L — — Blasts 1%–15% 15% 20% Basophils  20% — Platelets  or normal  or   Bone marrow Myeloid hyperplasia Cytogenetics Ph+ Bcr-Abl +

  19. Laboratorio: Fase crónica (cont) • Leucocitosis • Fórmula leucocitaria alterada • Basofilia • Eosinofilia • Anemia NN • Trombocitosis

  20. DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL LMC • Reacción leucemoide • Sepsis, inflamación, Ca, hemólisis • Granulación tóxica, Cuerpos de Döhle • FAN aumentadas • Ph (-) • Mielofibrosis con metaplasia mieloide • Poiquilocitosis (GR en lágrima) • FAN aumentadas • Fibrosis medular • Ph (-)

  21. Estudio citogenético Cariograma LMC 9 22 Menos sensible que RT-PCR abl-bcr

  22. Métodos moleculares para detectar bcr-abl cromosoma Ph FISH Fluorescence in situ hybridisation RT-PCR Reverse Transcriptasa Polimerase Chain Reaction

  23. Fluorescence in situ hybridisation (FISH) Labeled DNA probe(fluorescent) Interphase Metaphase Nuclear DNA bcr-abl gene Separate DNA strands and add labeled probe Labeled bcr-abl gene

  24. % Ph+ 100 80 60 Marrow 40 20 % Ph+ 0 0 20 40 60 80 100 Peripheral Blood FISH en MO y sangre periféricaAlta correlación resultados

  25. LMC AMPLIFICACIÓN DE GEN abl/bcr RT-PCR (Reverse Transcriptasa Polimerase Chain Reaction) • Más sensible que Cariograma (detecta 1 cél. malig. en >106 cél. N) • Detección cél. Ph+ ( Diagnóstico y post-trasplante MO) • MÉTODO • Obtención Cél. Mononucleares de MO • ( grad. de densidad) • Obtención de RNA • Transcripción reversa (obtención cDNA) • Transcriptasa reversa, “Primers” • Amplificación • DNA polimerasa, “Primers”, Oligonucleótidos , • Termociclador • Visualización del producto amplificado • Electroforesis Gel agarosa , • Bromuro de Ethidio , UV Etapas del RT-PCR Plasma Linfocitos FICOLL; d 1.077 PMN GR,

  26. PM Cont – Ph+ N DNA RT-PCR bcr-abl LMC

  27. LMC CRISIS BLÁSTICA • Periferia • Anemia • Trombocitopenia • Leucocitosis (>20% Blastos) • Leucopenia, Trombocitosis • Marcada displasia • Médula Ósea • Infiltración (mieloblastos) • Disminución series normales

  28. LMC Opciones terapéuticas • Trasplante alogénico de Progenitores hematopoyéticos. • Tratamientos basados en IFN-α • Quimioterapia: Hidroxiurea, Busulfan • Imatinib, Gleevec (STI571) • Transfusión GR (Anemia grave) • Transfusión plaquetas (Trombopenia marcada) • Antibióticos (Infecciones)

  29. Imatinib, Gleevec (STI-571)

  30. (STI-571) Tirosina Kinasa 210 kDa Tirosina Kinasa 210 kDa Ser474 Ser474 EGF-R EGF-R LMC LMC Imatinib: Mecanismo de acción (Inhibidor de tirosina kinasa)

  31. Imatinib: Mecanismo de acción (cont)

  32. LMC Trasplante de progenitores hematopoyéticos:Alta morbilidad y mortalidad Survival by Disease Stage, June 2001, based on transplants 1987 – Feb 2001. P=.0001

  33. LMC IFN- • IFN- tiene efectos biológicos múltiples: • Inhibe proliferación celular • Regula expresón de otras citoquinas • Modula el Sistema immune • Respuesta citogenética: puede ocurrir a 12 a 18 meses • Mejor sobrevida en casos Fase Crónica temprana • IFN- combinada con cytarabina (Ara-C): mejor respuesta

  34. IFN-a:Buen resultado en fase crónica temprana Phase Patients CHR MCR (n) (%) (%) Chronic <12 mo 274 80 38 >12 to <36 mo 72 62 8 >36 mo 42 49 8 Accelerated 61 52 7 Blast Crisis 5 20 0 CHR = complete haematological response; MCR = major cytogenetic response.

  35. LMC Quimoterapia es solo paliativa • Fármacos citotóxicos orales • Hydroxyurea • Busulfan • Respuesta Hematológica: 90% • Respuesta citogenéticas: 1%–5% • No modifica progresión de enfermedad

  36. LMC Bcr-Abl: Target terapéutico • Bcr-Abl: 95% pacientes • Bcr-Abl: Asociada a causa • Tirosina kinasa Bcr-Abl: Requerida para función celular de LMC.

  37. Imatinib: Inhibe selectivamente kinasas Kinases Inhibited Kinases Not Inhibited v-Abl 0.1–0.3 Flt-3 >10 p210Bcr-Abl 0.25 c-Fms, v-Fms >10 p185Bcr-Abl0.25 EGF receptor >100 TEL-Abl 0.35 c-erbB2 >100 PDGF-R 0.1 Insulin receptor >100 TEL-PDGF-R 0.15 IGF-1 receptor >100 c-Kit 0.1 v-Src >10 JAK-2 >100

  38. Imatinib Concentration (M) Imatinib inhibe crecimiento de células Bcr-Abl positivas U937* KG1* SU DHL1* KCL22† K562† KU812† *Bcr-Abl–negative cell lines. †Bcr-Abl–positive cell lines.

  39. LMC Imatinib: Resistencia ocurre principalmente en fase avanzada F. crónica F. blástica Recaida • Estados avanzados de Cas: multiples cambios genéticos • En fase acelerada: A menudo recaen con resistencia a quimioterapia. • En crisis blástica: Algunos rsponden pero recaen Haematopoietic differentiation Bone marrow to peripheral blood Ph-negative Ph+ blasts Ph+ Ph+ imatinib- resistant blasts

  40. Imatinib: Induce mayor respuesta citogenética *P<.001.

  41. Con Imatinib:Respuesta hematológica completa más rápida 100 94% Imatinib 90 80 70 60 55% IFN- + Ara-C 50 % Responding 40 30 20 10 0 0 3 6 9 12 15 18 21 Months Since Randomisation

  42. Con Imatinib:Cambios citogenéticos más rápidos 100 90 83% Imatinib 80 70 60 % Responding 50 40 30 20% IFN- + Ara-C 20 10 0 0 3 6 9 12 15 18 21 Months Since Randomisation

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