Identification de facteurs impliqués dans la Mécanosensibilité colique.

1. Identification de facteurs impliqués dans la Mécanosensibilité colique. • Alison Accarie / 1er année de thèse • Directeur de thèse : Pr. Michel Dapoigny • Directeurs du laboratoire : Pr. Alain Eschalier et Pr. Denis Ardid • UMR/INSERM 1107 Neuro Dol, Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la douleur

2. Introduction U1107 / Pharmacologie fondamentale et clinique de la douleur  prise en charge insuffisante des douleurs chroniques Axe : Douleur viscérale Douleurs abdominales Douleurs coliques • Première cause de consultation en gastroentérologie • Symptôme commun au SII et MICI en période de rémission SII : syndrome intestin irritable MICI : maladie inflammatoire chroniques de l’intestin

3. Introduction Douleurs coliques 2/3 des cas hypersensibilité colique • réponse exacerbée à un stimulus douloureux ou non • sensibilisation au niveau périphérique (organe cible) • Probablement d’origine mécanique • Compression d’organes (cancer) • Distension (ballonnements)

4. Introduction • mécanosensation colique : • différents senseurs périphériques Intégration centrale

5. Introduction Mécanosensibilité colique : implication de canaux ioniques Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010 ASIC (Acid sensing ion channels): sensible au pH TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) : sensible au chaud TRPA (Transient Receptor Potential family A): sensible au stretch, température et irritants Senseurs périphériques? Pas de rôle clair.

6. Introduction Identification d’un nouveau Facteur de Transcription dans cas de stimulation mécanique des tiges chez Arabidopsis & Popular sp. (Equipe MECA, UMR PIAF) PtaZFP2 Expression précoce Motif doigt de zinc Mécanosenseurs présents aussi chez les plantes, avec équivalent génique chez l’animal

7. Introduction Cinétique d’expression courte Induit pour une stimulation Phénomène de sensibilisation Martin, 2009 NGF1-C/egr-4 équivalent génique de PtaZFP2 chez la souris

8. Introduction Famille Egr : 4 sous types Facteur de transcription / Gène de réponse précoce Structure à doigt de zinc liaison à l’ADN Cys2-His2 Modulation d’expression de gènes lors de la transmission nerveuses Même séquence de reconnaissance de l’ADN : GCC G/TGG GCG Induction par NGF (culture cellulaire ) Impliqué dans stimuli douloureux Zhican Qu 1998

9. Introduction Egr-4 : Deux principales études Impliqué dans mecanosensation (vibris et cortex somata-sensoriel) suite à un stimulus mécanique physiologique PCR ARNm egr-4 (Mack et al., 1995).

10. Objectif de la thèse Implications et rôles du facteur de transcription EGR-4 en tant mécano senseur

11. Objectifs Implications et rôles du facteur de transcription EGR-4 en tant que mécanosenseurs Egr-4 impliqué dans Hypersensibilité colique chez l’animal? Quels sont ces partenaires? Par quels mécanismes cela passe-t-il?

12. Plan de travail Rôle dans Mécanosensibilité viscérale? Dans quels tissus et à quel moment est-il le plus présent? Souris saines Caractérisation de la cible Quels sont les partenaires?

13. Plan de travail Rôle dans Mécanosensibilité viscérale? Dans quels tissus et à quel moment est-il le plus présent? Souris saines Caractérisation de la cible Quels sont les partenaires? Modification d’expression? Modèle post-infectieux Cinétique différente? Implication dans hypersensibilité colique? Changement de partenaires? Modèle stress

14. Protocole • Souris wt sans traitement. • Distension à 100 µL pendant 10 s. • Prélèvement 30 min, 1h30 et 3h30 après distension. • Colon • Partie distendue • Moelle • DRG viscéraux • L6 et S1 seringue + sonde rectale

15. Premiers résultats IHC Anticorps au point pour les trois structure Colocalisation avec des fibres nerveuses plus précisement sensitives Egr-4 nucléaire et/ou cytoplasmique Paraffine Anti-NGFI-C 1:500 Anti-goat (secondaire) 1:1000

16. Premiers résultats IHC Colon seringue + sonde rectale

17. Premiers résultats IHC Colon DRG cytoplasme DRG noyau

18. Premiers résultats IHC Colon DRG cytoplasme DRG noyau Corne dorsale de la moelle épinière

19. Egr-4 colon souris distendus vs non distendus COLON protéine ARNm C 30 1h30  baisse d’expression de egr 4 au niveau colique

20. Egr-4 DRG souris distendus vs non distendus DRG ARNm protéine C 30 1h30  baisse d’expression de egr 4 dans les DRG

21. Egr-4 moelle souris distendus vs non distendus Moelle ARNm protéine C 30 1h30  augmentation de EGR4 dans la moelle.

22. Conclusion • Outils d’études (PCR, WB, IHC) disponibles et mis au point • Résultats avec des tendances différentes de ceux obtenus chez la plante et au niveau cérébral chez la souris (confirmation en cours). • Confirmation de l’intérêt de l’étude de cette cible dans la mécanosensibilité

23. Suite du travail • Cinétique d’expression du facteur. ARNm DCR 30 (45) 1h (1h15) 1h30 Proteine DCR (1h) 1h30 (2h) 2h30 (3h) 3h30

24. Suite du travail • Cinétique d’expression du facteur. • Localisation plus fine en immunohistologie (wholemount).

25. Suite du travail • Cinétique d’expression du facteur. • Localisation plus fine en immunohistologie (wholemount). • Identification des cibles et partenaires. choc osmotique qPCR WB microarray Culture cellulaire MODE-K

26. Merci de votre attention

27. Corrélation volume de distension-expression egr-4 ARN m et protéine Distension des animaux avec différents volumes : 20 µl 40 µl 60 µl 80 µl 100 µl 120 µl qPCR Prélèvements au temps choisis Western Blot

28. Modèle post-infectieux Souris KI pour le gène humain ceacam6 : site de liaison LF82  meilleure implantation des bactéries J-3 J-2 J0 J1 J2 J3 J9 Gavage PBS ou 109 CFU/souris (AIEC LF82 ouMG1655) Implantation électrodes Distension colorectale Administration néomycine (2 g/mL) dans eau de boisson

29. Résultats modèle post-infectieux DCR J9

30. Résultats modèle stress • Réponse moyenne de sensibilité colique DCR réalisée à l’age adulte