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东北师范大学生物基础实验教学中心. 生物化学实验 —— 层析技术. 张丽萍 台桂花. 目录. 一 . 薄层层析 二 . 聚酰胺薄膜层析 三 . 凝胶层析 四 . 离子交换层析 五 . 亲和层析 六 . 高效液相色谱 七 . 气相色谱 八 . 超临界流体色谱. 层析技术. 层析技术是一类物理分离方法 , 根据待分离混合物中各组分物理化学性质的差别 , 使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中 , 由于各组分随流动相前进的速度不同 , 从而得到有效分离。. 一 . 薄层层析. 常用的支持剂有 : 硅胶 G 、 硅胶 GF 、氧化铝、

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东北师范大学生物基础实验教学中心

生物化学实验——层析技术

张丽萍 台桂花


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目录

  • 一.薄层层析

  • 二.聚酰胺薄膜层析

  • 三.凝胶层析

  • 四.离子交换层析

  • 五.亲和层析

  • 六.高效液相色谱

  • 七.气相色谱

  • 八.超临界流体色谱


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层析技术

  • 层析技术是一类物理分离方法,根据待分离混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中,由于各组分随流动相前进的速度不同,从而得到有效分离。


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一.薄层层析

  • 常用的支持剂有:

    硅胶G、 硅胶GF 、氧化铝、

    纤维素、硅藻土、纤维素G 、

    硅胶G硅藻土、 DEAE-纤维素、

    交联葡聚糖凝胶等。


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中药的薄层色谱分析

  • 薄层色谱在如下方面可选择性比较大

  • 固定相

  • 展开剂的展开方式

  • 显色剂

  • 检测方法

  • 含量测定方法


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中药的薄层色谱分析


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中药的薄层色谱分析

  • 传统的薄层扫描硅胶柱分离人参皂甙的TCL图


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中药的薄层色谱分析

  • 白屈菜中异喹啉生物碱的薄层扫描图

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二.聚酰胺薄膜层析

  • 聚酰胺以其 —CO—或—NH—与极性化合物的—OH或=O之间形成氢键,从而发生吸附作用。

  • 被分离物质在溶剂和薄膜之间按分配系数的大小,发生不同速率的吸附与解吸过程,从而是混合物得到有序的分离。


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三.凝胶层析

  • 常用的材料有:

    交联葡聚糖(sephadex)

    交联琼脂糖(sepharose CL)

    聚丙烯酰胺凝胶(biogel P)

    琼脂糖(biogel A)

    多孔玻璃(bio glass)

    聚苯乙烯(bio-beads)等。


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四.离子交换层析

  • 离子交换层析是根据物质的酸碱性、极性和分子大小的差异而预以分离的柱层析技术。

  • 带有酸性可电离基团的以—SO3H表示,称为阳离子交换树脂;

  • 带有碱性可电离基团的以R4NOH表示,称为阴离子交换树脂。


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四.离子交换层析

  • 常用的阴离子交换纤维素有:

    磺酸甲基纤维素(SMC)

    羧甲基纤维素(CMC)

    磷酸基纤维素(PC)

  • 常用的阳离子交换纤维素有:

    二乙基胺乙基纤维素(DEAEC)

    三乙基胺乙基纤维素(TEAEC)


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五.亲和层析

  • 亲和层析是利用配基、配体之间专一可逆结合性质进行物质分离的方法,因此其专一性、选择性是极高的。

  • 常用的配位体有:

    三嗪染色剂,用于蛋白质的纯化;

    酶的底物或偶联因子,用于特定酶的纯化;抗体,用于相应的抗原;

    抗体,用于相应的抗原;

    蛋白质A,用于IgG抗体的纯化;

    单链寡核苷酸,用于互补的核酸如mRNA,或特定的单链DNA序列;

    凝集素,用于特定的单糖亚基。


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层析聚焦(Chromatofacusing)

  • 原理:

    (1)pH梯度溶液的形成例:PBE94阴离子交换剂起始buffer平衡到pH=9洗脱液pH=6

    (含polybuffer96---为Mw不同的多羧多氨化合物)


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层析聚焦(Chromatofacusing)

  • 原理:

    (2)蛋白质的层析聚焦 层析介质pH〈 pI Pr+下移 层析介质pH 〉pI Pr-与柱结合 洗脱过程,pH下降 当pH =pI Pr0下移Pr按pI大小而被分离


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层析聚焦(Chromatofacusing)

  • 原理:

    (3)聚焦效应Pr按pI在pH梯度环境中进行排列的过程为聚焦效应。①Pr首先迁移至其pI位置。②Pr 与交换剂重复吸附、解吸附过程。③pH<pI,Pr被洗出。


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疏水层析(hydrophobic interaction chromatography,HIC)

  • 特点:利用样品与介质疏水性大小进行分离,样品不必脱盐。

  • 原理:1.疏水作用,Pr与疏水固定相结合。 (1)Pr表面的疏水补丁。 (2)Pr局部变性,暴露疏残基。

    (3)高盐浓度下 1mol/L(NH4)2SO4,2mol/LNaCl,

    Pr表面疏水表面与固定相结合。


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疏水层析(hydrophobic interaction chromatography,HIC)

  • 原理:2.吸附剂: 配体:苯基C6,辛基C8,烷基C18介质:硅胶、树脂如phenyl、

    sepharose FF 、

    sepharose CL-4B


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疏水层析(hydrophobic interaction chromatography,HIC)

  • 洗脱:盐浓度高,疏水弱的Pr先流出; 盐浓度低,疏水强的Pr后流出。


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反相层析(reversed phase chromatography)

  • 特点:基质结合配体密度大、疏水性强,对Pr类吸附性强,洗脱加有机相Pr易变性。


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常用凝胶型号举例

  • Spandex G(10-200)

    (1)数大,交联度小,网孔大 (2)代表持水量,G-25,1g干胶持水2.5ml.

  • Sephadex LH-20 亲脂性,适用于脂类、维生素、激素类分离

    (先洗脱为有机溶剂)


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常用凝胶型号举例

  • SE-sephadex

    带磺乙基 –OC2H4SO3Na

  • CM- SE-sephadex C-25带羧甲基 –CH2COOH C表示阳离子

  • DEAE- SE-sephadex A-25二乙胺基乙基 –OC2H4NH (C2H5)2CL A表示阴离子


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常用凝胶型号举例

  • Bio-Gel P300聚丙烯酰胺凝胶P后数×1000=Pr排阻限度

  • Sepharose 2B、4B、6B数后为干胶的百分含量

  • 美国Bio-GA A=0.5 、1.5、5、15、50、150M数×106为排阻限度


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常用凝胶型号举例

  • 瑞典Sagavac 2F、4F等 2C、4C等 数表示干胶的百分含量 F——表示粉末 C——表示颗粒

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六.高效液相色谱

  • 溶剂输送系统(高压泵)

  • 进样系统(进样阀)

  • 分离系统(色谱柱)

  • 检测系统(检测系统)


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六.高效液相色谱

  • 色谱在中药研究及质量控制中的应用

    药材质量控制

    过程控制

    评价体系


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丹参的质量控制


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单煎与合煎化学物质的异同性比较


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泽泻的质量控制

正己烷提取物气相色谱

乙醇提取物HPLC


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茯苓的质量控制

正己烷提取物气相色谱

乙醇提取物HPLC


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0.40

0.35

0.30

0.25

0.20

AU

0.15

0.10

0.05

0.00

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

55.00

60.00

65.00

70.00

Minutes

川芎、天麻甲醇提取物HPLC谱图比较

天麻

川芎


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丹参提取物D1及其体外代谢物的HPLC分离谱图

代谢后

代谢前


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多维色谱分离新领域

  • 理论证明混合多维分离模式所具有的峰容量接近各维分离峰容量的乘积。

  • 高效液相色谱,离子色谱,凝胶色谱和毛细管电泳之间均可以发展混合模式多维分离新技术。


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多维液相分离模式

  • 2-D HPLC 装置图

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七.气相色谱


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中药药效物质的气相色谱分析

  • 气相色谱适于分析本身具有或经过衍生化后具有挥发性和热稳定性的化合物。

  • 气相色谱分离的优点为快速、分离效率高、灵敏度高、便于与质谱联用。


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Column 1

Column 2

Injector

TOFMS

中药药效物质的气相色谱分析

  • GCxGC-TOFMS 中药分析的新型工具


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中药药效物质的气相色谱分析

  • 全二维气相色谱的特点

    分辨率高、峰容量大。

    灵敏度高。

    分析时间短。

    定性可靠。


Db5 ms 30mx0 25mm 60c 3c min to 210c 35 cm s

DB5-ms 30mx0.25mm,柱温:60C,3C/min to 210C,线速:35 cm/s。

中药药效物质的气相色谱分析

  • 广霍香的一维分离谱图


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广藿香GCxGC-TOF-MS 分析

柱系统: 2mx0.1mmx3.5um (DB-1); 40cmx0.1mmx0.1um OV-1701

柱温:45C,3.5C/min,220C.

广藿香GCxGC-TOFMS TIC

氧化产物

单萜

广霍香的GCxGC-FID分离


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未破壁孢子粉粗多糖的G.C.图谱


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破壁孢子粉粗多糖G.C.图谱

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八.超临界流体色谱

  • 超临界流体色谱 (supercritical fluid chromatography, SFC) 是以超临界流体(SF)作为流动相的色谱分离模式。SFC以其流动相的特殊性质而在分离分析领域占有一席之地,可作为气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)的重要补充技术。


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八.超临界流体色谱

  • 特点:

    SFC既可分离GC不适应的高沸点、低挥发性的样品,又比HPLC具有更快的分离速度和柱效率。

    其应用领域非常广泛,可用于分离分析热敏性物质、非挥发性高分子、生物大分子、极性物质和手性对映体等。

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