Extração e purificação
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Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de Corynebacterium pseudotuberculosis PowerPoint PPT Presentation


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Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de Corynebacterium pseudotuberculosis. Revisão bibliográfica Os antígenos Extração Purificação Material e método Extração Purificação. Representação esquemática da localização das frações antigênicas de C. pseudotuberculosis. Ag.

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Extração e purificação dos antígenos imunodominantes de Corynebacterium pseudotuberculosis

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Presentation Transcript


Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

Extração e purificação

dos antígenos imunodominantes de

Corynebacterium pseudotuberculosis

  • Revisão bibliográfica

    • Os antígenos

    • Extração

    • Purificação

  • Material e método

    • Extração

    • Purificação


  • Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

    Representação esquemática da localização das frações antigênicas de C. pseudotuberculosis

    Ag.

    Extra

    celulares

    Ag. de parede /

    membrana

    Peptidoglicano

    Ácidos

    teicóicos

    Ag.

    Intra

    celulares?

    Membrana

    Parede

    Camada

    lipídica

    Ag. fracamente

    ligados à parede


    Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

    As frações antigénicas de

    Corynebacterium pseudotuberculosis

    Antígenos extracelulares

    Antígenos fracamente ligados à parede

    Antígenos celulares (parede/membrana, intracelulares)


    Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

    Extração dos antígenos de C. pseudotuberculosis


    Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

    Purificação dos antígenos de C. pseudotuberculosis


    Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

    S-Layer (1)


    Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

    Extracelulares (4)


    Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

    Celulares (3)


    Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

    Obtenção de soro para imunodifusão e Cromatografia de imunoafinidade

    (E. Harlow and D. Lane, 1988, Weare et al, 1982)

    Imunodifusão

    Frações antigénicas extraídas (4)

    C. Imunoafinidade Reversa

    Frações obtidas a partir de PAGE NÃO DESNATURANTE

    • Esquema de vacinação: (3 coelhos por extrato)

    • Injeção inicial SC: 0,5 mg de proteína com adjuvante de Freund completo,

    • Boosts a cada 30 dias, 0,25 mg, SC (Freund incompleto) ou IV (Ag sem adjuvante)

    • Sangria 15 dias após cada boost.

    • Preparação do soro:

    • Aquecimento 56ºC, 30 min.

    • Precipitação com (NH4)2SO4 ou Cromatografia Exclusão

    • Resuspensão em NaHCO3(CIAR)

    • Desalinização (Diálise ou Sephadex G-25) (ID)


    Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

    Celulares (3)

    Extracelulares (4)

    PAGE não desnaturante

    Bandas contaminantes

    Gel de Sepharose 6MB

    ativado com Brometo

    de cyanógeno

    +

    Sóro anti

    “Contaminantes”

    Cromatografia de Imunoafinidade Reversa


    Extra o e purifica o dos ant genos imunodominantes de corynebacterium pseudotuberculosis

    Controle de qualidade

    Extração por detergentes/Sonicado

    Outros Extratos

    E. Intracelulares (2)

    Lowry

    PAGE / Imunoblot

    E. S-Layer (1)

    E. Celulares (3)

    E. Extracelulares (4)

    EXTRAÇÃO

    Soro ID (4)

    Extratos 3 e 4

    Extratos 1 e 2

    • Lowry

    • Soro ID

    • PAGE / Imunoblot

    C. I. A. R.

    C. Exclusão

    C. Exclusão

    PURIFICAÇÃO


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