Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 24

Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov PowerPoint PPT Presentation


  • 70 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Univerzita Pavla Jozefa Šafárika Katedra biochémie. Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov. Mgr. Kamil Tóth. … Danišovce 2006. Yellowstone 1969. Kamil Tóth. Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov. ● biokatalyzátory chemických reakcií. ● metabolické premeny urýchľujú ~ 10 6 x.

Download Presentation

Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Univerzita Pavla Jozefa ŠafárikaKatedra biochémie

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Mgr. Kamil Tóth

…Danišovce 2006

Yellowstone 1969...


Enz my

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

●biokatalyzátory chemických reakcií

●metabolické premeny urýchľujú ~ 106 x

●najrýchlejší enzým orotidín monofosát dekarboxyláza ~ 1017 molekúl/sek.

●v primárnej sekvencii zložené z 20 AMK

●enzýmy

proteíny

Enzýmy


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

●ich štruktúra je tvorená:

kofaktor

apoenzým

●aktívne miesto – oblasť katalýzy

●evolúcia – selekcia katalytických skupín

●vysoká špecificita ”key and lock”

●prevaha nekovalentných interakcií

●dynamické štruktúry


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

●metabolické dráhy

●imunitný systém

●proteosyntetický aparát...

●bunka živých sústav ~ 3000 enzýmov

●niektoré organizmy sa prispôsobili extrémnym podmienkam...

Kde sa enzýmy vyskytujú?

... všade tam, kde prebieha život


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Acidofily

pH 1-5

Barofily

Halofily

1-700 atmosfér

>2M soľ

Psychrofily

(Mezofily)

25-40°C

-10 až 20°C

50-105°C

Termofily

termofily 50-80°C

hypertermofily >80 °C

Extrémofily

●odolnosť v extrémnych podmienkach-vnútorná vlastnosť

„dynamická povaha termostability“


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

NADH oxidáza z Thermus thermophilus

kooperácia Prof. Sprinzl, Lehrstuhl Biochemie, Universität Bayreuth, Nemecko

●50 kDa homodimér

●FMN alebo FAD ako kofaktor/monomér

●NADH dehydrogenáza

●pI 9,26

●hypertermofil Topt.=82°C

●neznáma fyziologická funkcia


Nadh oxid za je flavoprote n

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

●proteíny, ktoré majú ako kofaktor naviazaný FAD, FMN alebo iný flavínový derivát

●až  65% flavoproteínov viaže FAD ako kofaktor

Biologická všestrannosť

●Citrátový cyklus

●oprava poškodených reťazcov DNA

●rezistencia na tetracyklínové antibiotiká

●Cirkadiálny rytmus – regulácia biologických hodín

●indikátory metabolického a nutričného stavu buniek

NADH oxidáza je flavoproteín


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

flavínmononukletid(FMN)

adenozínmonofosfát (AMP)

D-ribitol

adenozín

ribolflavín

izoalloxazínflavín

Štruktúra FAD

flavínadenindinukleotid (FAD)


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

●flavínový kruh pôsobí ako reverzibilný redoxný systém

ChinónSemichinón Hydrochinón

„Motýlí ohyb“

zbalená forma

rozbalená forma


Ciele pr ce

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Ciele práce:

A

●aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy

B

●vytvorenie nehomológnej databázy FAD viažúcich proteínov

●charakteristika interakcií kofaktora a proteínovej časti

●sledovanie preferenčných konformácií voľného FAD a viazaného v aktívnych miestach


V znam

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Význam:

●základný výskum

●biotechnologický priemysel


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

i) zásahom do primárnej sekvencie – bodové mutácie

ii) pôsobením externe modulovaných podmienok

?

soli Hofmeisterovej série

...ako je to in vivo

Na+, Gdm+, NH4+, Li+, K+ ,Cs+

●priama interakcia s proteínom

●cytozol 300mg proteínov/ml

●nepriama s molekulami H2O

●existencia voľnej H2O?

Aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Mechanizmus pôsobenia

KM,NADH KM,FMN

rovnica Michaelis-Mentenovej

●v ~ aktivita enzýmu

●KM konštanta- miera afinity enzýmu pre substrát


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

●pozitívne nabité aktívne miesto

●nešpecifická aktivácia

●nepriamy efekt na oblasť aktívneho miesta

●nízka koncetrácia solíelektrostatické interakcie

●vysoká koncetrácia solíHofmeisterov efekt


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Stanovenie KM konštanty pre substrát NADH

●charakteristika interakcie enzým-substrát

●konformačná bariéra

●pre 2M soli

K+Na+Cs+> NH4+>Li+>> Gdm+


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

●vytienenie nevýhodných elektrostatických interakcií

●kozmotrópne Li+ stabilizuje štruktúru

●chaotrópne katióny znižujú afinitu

Stanovenie KM konštanty pre FMN ako kosubstrát

●komplexný problém objasnenia Hofmeisterovho efektu


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

●plocha prístupná pre rozpúšťadlo: ASA v Å2

●gyračný polomer: Rg v Å

B.Analýza flavínových kofaktorov v aktívnych miestach

●početnosť tvorby vodíkových väzieb subštruktúry FAD


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

●537 flavoproteínov (RCSB Protein Databank)

●55 ortológov

●100 kofaktorov

●priemerné rozlíšenie ~ 2.06 Å

98% oxidoreduktázy

46% α/β štruktúra

Databáza flavoproteínov


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Distribúcia vodíkových väzieb v aktívnych centrách enzýmov

● kritérium rozlíšenia: < 2Å

● 24 flavoproteínov

● parameter popisujúci interakcie v aktívnych miestach

sila interakcie vodíkovej väzby:

izoalloxazín<pyrofosfát~adenozín<ribityl


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Konformácia kofaktorov v aktívnych miestach enzýmov


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

o

●korelácia ASA – plochy prístupnej pre rozpúšťadlo a gyračného polomeru Rg (R=0.844)

o

Charakteristika rozbalenej konformácie FAD

● ASA – plocha prístupná pre rozpúšťadlo

●  Rg -gyračný polomer

●  schopnosť tvorby vodíkových väzieb


Zhrnutie

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Zhrnutie:

  • úspešná aktivácia NADH oxidázy katiónmi Hofmeisterovej série

  • 537 flavoproteínov → databáza 55 nehomológnych flavoproteínov → 100 kofaktorov

  • určená ASA a bimodálna distribúcia konformácie kofaktora pre oblasť aktívnych miest 75% FAD v rozbalenej a 25% v zbalenej konformácii


Optimali z cia aktivity termofiln ch enz mov

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

...čo do budúcna?

●stanovenie nitroreduktázovej aktivity NADH oxidázy z Thermus thermophilus

●sledovanie aktivity NADH oxidázy v nepolárnych prostrediach

●viazanie flavínového derivátu do apoformy enzýmu


Po akovanie

Kamil Tóth

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

RNDr. Gabrielovi Žoldákovi, PhD.

RNDr. Erikovi Sedlákovi, PhD.

Prof. Dr. Mathiasovi Sprinzlovi

Poďakovanie

Vám za vašu pozornosť!


  • Login