LA  VIE  TREPIDANTE  DES  ELECTRONS
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LA VIE TREPIDANTE DES ELECTRONS DANS LES ENZYMES D’OXYDO-REDUCTION Patrick BERTRAND PowerPoint PPT Presentation


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LA VIE TREPIDANTE DES ELECTRONS DANS LES ENZYMES D’OXYDO-REDUCTION Patrick BERTRAND Professeur à l’Université de Provence Aix-Marseille 1 Collège de France, 8 avril 2009.

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Presentation Transcript


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

LA VIE TREPIDANTE DES ELECTRONS

DANS LES ENZYMES D’OXYDO-REDUCTION

Patrick BERTRAND

Professeur à l’Université de Provence

Aix-Marseille 1

Collège de France, 8 avril 2009

P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 [email protected] http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

SRED + AOx  SOX + ARED

SRED

SOX

H+

ARED

AOX

SRED

SOX

e-

site

actif

e-

e-

P. Bertrand, Séminaire au collège de France le 08/04/09 [email protected] http://bip.cnrs-mrs.fr/bip06

centres

rédox

e-

e-

Q

e-

AOX

ARED

quinone

H+

ENZYME

D’OXYDO-REDUCTION

COMPLEXE

BIOENERGETIQUE


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

LES PROPRIETES EXTRAORDINAIRES DES ELECTRONS

CAS D’UN ELECTRON LIBRE

Probabilité de présence: ( (x,t) )2

(x,0)

x0

t = 0

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x

0

(x,t)

Instant t

x(t)

x

0

L’électron se délocalisespontanément

A quelle vitesse ?


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

UN PETIT CALCUL

x(t) =

  • - électron(me= 9,1 x 10-31 kg) avec x0 = 1Å

  • x = 12 Å t = 10-15 s

  • x =1,2 mm t = 10-9 s

  • objet d’un kilogramme avec x0 = 0,1 mm

  • x = 1mm pour t = 30 x 1018 ans

  • (âge de l’Univers : 13 x 109 ans)

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La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

DANS LES MOLECULES, LES ELECTRONS NE SONT PAS LIBRES !

Charge négative : interagissent avec les noyaux et les autres électrons

Mais très petite masse

  • délocalisationdans des orbitales moléculaires : notion de densité électronique

  • s’ adaptent instantanément aux variations de géométrie:

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vibrations moléculaires

La densité électronique

s’étire et se contracte

en suivant les mouvements des noyaux


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

LES TRANSFERTS D’ELECTRONS A LONGUE DISTANCE

énergie potentielle

ARED

BOX

état

initial

ER

Qi

initial

final

Ea

U

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Q*

Q*

Qf

Qi

géométrie

kP exp(- Ea /RT )

AOX

BRED

état

final

Qf


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

EXPRESSION DE LA CONSTANTE DE VITESSE

Analyse plus détaillée (R. Marcus, Prix Nobel de Chimie 1992)

  • U remplacé par G°(variation d’enthalpie libre standard de la réaction)

    G°= - ℱ E°, avec E° = E°B - E°A potentiels rédox standards

  • P : facteur électronique : carré recouvrement des orbitales (distance et masse)

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La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

ET LE TRANSFERT INVERSE ?

état initial

état final

ARED

BOX

BRED

AOX

k1

k-1

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k1 et k-1 : même Pet même ER , mais G°- G°

k1 /k-1 = exp(-G°/RT)


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

UNE PROPRIETE REMARQUABLE : VARIATION DE k1 AVEC E°

k1

A

B

E° = E°B – E°A

k-1

E°A

E°B

ln k1

ln k-1

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pente = 1/2RT

ℱ E°

0

ER

Dans les molécules biologiques : ℱ E° < ER ( 0,5 à 1 eV)

régime « normal » : k1augmente avec E°


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

DES CHAINES DE TRANSFERT D’ELECTRON DANS LES ENZYMES

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LE COMPLEXE I MITOCHONDRIAL

Sazanov et al., Science (2005, 2006)


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

COMMENT OPTIMISER UNE CHAINE DE TRANSFERT D’ELECTRON ?

k1

E° = E°B – E°A

k1 / k-1 = exp(ℱ E°/ RT)

A

B

UN MAILLON :

k-1

E°A

E°B

Pour privilégier le transfert de A vers B ( k1 >> k-1 ) : ℱ E° >> RT

à T = 300 K , E° = 100 mV  k1 /k-1 = 50

E° = 200 mV k1 /k-1 = 2500

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UNE CHAINE « DIRECTIONNELLE »

k1

k2

k3

A

B

C

D

k-3

k-1

k-2

E°A

E°A+200 mV

E°A+300 mV

E°A+100 mV


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LE PRIX A PAYER

k1

k2

k3

?

A

ACCEPTEUR

B

C

D

k-1

k-2

k-3

E°A

E°A+ 200 mV

E°A+ 100 mV

E°A+ 300 mV

  • Les électrons sur Dont perdu beaucoup de leur pouvoir réducteur

     La biosynthèse des centres rédox coûte cher aux organismes vivants

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LA SOLUTION : DIMINUER LE NOMBRE D’INTERMEDIAIRES

k1

ACCEPTEUR

A

B

k-1

E°A + 100 mV

transfert d’électron

à longue distance

E°A

LA NATURE PROCEDE -T- ELLE AINSI ?


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

LA NATURE A TRES BIEN FAIT LES CHOSESDANS

LES CENTRES REACTIONNELS DE LA PHOTOSYNTHESE

énergie

lumineuse

Catalysent les réactions : DRED + AOX +  DOX + ARED

DOX

DRED

e-

Les transferts

doivent être

extrêmement rapides

pour que les électrons arrivent

sur l’accepteur

h

e-

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P

e-

e-

AOX

ARED


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LE CENTRE REACTIONNEL BACTERIEN

h

P870

B

e-

17 Å

H

13 Å

QB

QA

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18 Å

P* HOX QAOX

3 x 1011 s-1

POX HRED QA OX

5 x 109 s-1

h

109 s-1

POX HOX QARED

108 s-1

104 s-1

10 s-1 (25 Å)

P HOX QAOX


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

QU’EN EST-IL DANS LES ENZYMES D’OXYDO-REDUCTION

« ORDINAIRES » ?

LES CENTRES REDOX

Les centres fer-soufre

Les hèmes

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2Fe-2S

3Fe-4S

4Fe-4S


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

La succinate deshydrogénase (Complexe II mitochondrial)

fumarate

site actif : flavine

succinate

- 80 mV

+30 mV

13 Å

2Fe-2S

0 mV

14 Å

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4Fe-4S

- 260 mV

e-

13 Å

UQH2

+ 60 mV

UQ

3Fe-4S

+ 60 mV

ubiquinone

Structure : Iverson et al., Science (1999)

UQ

UQH2

+ 60 mV


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

LES HYDROGENASES A NICKEL-FER

site actif : Ni-Fe

2 H+

H2

- 350 mV

- 420 mV

12 Å

4Fe-4S

- 350 mV

12 Å

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3Fe-4S

+ 65 mV

12 Å

4Fe-4S

e-

- 350 mV

cytochrome

red

cytochrome

ox

- 300 mV

cytochrome

- 300 mV

Structure: Volbeda et al., Nature (1995)


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

  • Que faut-il en déduire ?

  • Les transferts d’électrons limitent-ils l’activité des enzymes ?

  • Les potentiels rédox mesurés sont-ils pertinents ?

  • La théorie du transfert d’électron doit-elle être révisée ?

  • Il faut comparer

  • - l’activité des enzymes

  • - la vitesse des transferts d’électron

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La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

ACTIVITE DES ENZYMES D’OXYDO-REDUCTION

  • mélange (SRED, AOX)

  • A t = 0, on ajoute l’enzyme et on mesure la vitesse

    initiale :

    vi=

SRED

SOX

site actif

  • viproportionnelle à [enzyme] : activité (M s-1)

    dépend de processus très variés

  • intermoléculaires : diffusion

  • SRED site actif

  • AOX site favorable au TE

  • intramoléculaires :

  • chimie au site actif

  • transferts de protons

  • transferts d’électrons

e-

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centres

rédox

e-

e-

AOX

ARED


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LA CONSTANTE CATALYTIQUE kCAT

  • Quand [SRED]0 et [AOX]0 assez grandes (saturantes) :

    Vi ne dépend que des processus intramoléculaires

    Vi = kCAT [enzyme]

  • cycle catalytique

SOX

SRED

e-

E

kCAT = nombre de cycles

par seconde

k1

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e-

E4

E1

modèle cinétique

kCAT = f(k1, k2, k-2, …)

e-

k-2

k2

AOX

ARED

E3

E2

Si étapes quasi irréversibles : 1/kCAT = 1/k1 + 1/k2 + 1/k3 + 1/k4 + 1/k5

Notion d’étape limitante


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

LES LACCASES

Substrats aromatiques

E°’ très positifs

SRED

SOX

Champignons, plantes, insectes, bactéries

Enzymes peu spécifiques

Applications biotechnologiques

MOX

MRED

médiateurs

S met

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E°’ + 400 à + 800 mV

e-

Cu

S cys

His N

T1

N His

e- (rapide)

site actif

(Cu trinucléaire)

e-

transfert d’électron médiateur  T1 : limitant ?

Etude bibliographique

O2

2H2O

+ 940 mV

pH 5


Variation de k cat en fonction de e e t1 e med

VARIATION DE kCAT EN FONCTION DE E° = E°’(T1) – E°’(med)

Série de 10 laccases, même médiateur

médiateur (non phénolique) = ABTS

E°’= + 700mV, pH 5

kCAT (s-1)

pente = 1/(2RT)

ln k1

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0

ER

ℱ E°


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VARIATION DE kCAT EN FONCTION DE E° = E°’(T1) – E°’(med)

Une laccase (Polyporus pinsitus)

E°’(T1) = 790 mV

Série de 24 médiateurs , pH 5

ENSEMBLE DES DONNEES

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ER

Kulys et al., JBIC (2000)


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

LES TRANSFERTS D’ELECTRONS SONT-ILS

LIMITANTS DANS LES LACCASES ?

 Le paramètre kCAT dépend de E° = E°’(T1) - E°’(médiateur)

 Dépendance conforme « en moyenne » à celle attendue

pour k (transfert électron)

 Grande dispersion par rapport à la moyenne :

- Facteur électronique du transfert d’électron ?

- Autres facteurs, indépendants du transfert d’électron ?

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La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

LE FLAVOCYTOCHROME b2 DE Saccharomyces cerevisiae

- 190 mV

FOXHOX

pyruvate

cyt red

lactate

L-lactate

pyruvate

+ 2H+

FRED

E1°= - 135 mV

FSQ

E2°= - 45 mV

FOX

cyt ox

FREDHOX

FOXHRED

 

e-

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EH°- E1°

= 130 mV

EH °-E2°

= 40 mV

E°H

= - 5 mV

FSQHRED

FSQHOX

e-

cyt red

cyt ox

+ 260 mV

cytochrome

ox

cytochrome

red

kCAT = 160 s-1 (30°C, pH7)

Expériences de saut de température

sur formes sauvage et mutées


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

MESURE DES CONSTANTES DE VITESSE (16°C)

lactate

pyruvate + 2H+

 

FOXHRED

FREDHOX

k2

k1

FSQHRED

FSQHOX

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kCAT

(30°C,pH7)

EH °-E2°k2

EH°- E1°k1

Forme sauvage: 160 s-1 40 mV, 170 s-1 130 mV, 1500 s-1

Y143 F : 60 s-1 - 25 mV, 50 s-1 150 mV -

Y254 F : 15 s-1 -10 mV, 27 s-1 145 mV -

CONCLUSION : transfert d’électron « partiellement limitant »

Tegoni et al, Biochemistry (1998)


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

LES HYDROGENASES A NICKEL-FER

2 H+

- 420 mV

  • Très courtisées actuellement

  • Production de H2 à partir de H2O et

  • énergie solaire.

  • Catalyseur dans biopiles H2/O2

H2

site actif : Ni-Fe

- 350 mV

4Fe-4S

- 350 mV

Étape

limitante ?

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Pourquoi un centre

de haut potentiel ?

3Fe-4S

+ 65 mV

Pourquoi un

ligand histidine ?

4Fe-4S

cytochrome

- 300 mV

- 350 mV


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REMPLACEMENT DU CENTRE 3Fe-4S PAR UN CENTRE 4Fe-4S

- 350 mV

3Fe-4S

+ 65 mV

- 350 mV

Forme sauvage

N-His

cytochrome

kCAT = 1050 s-1

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4Fe-4S

- 250 mV

- 380 mV

- 380 mV

Forme mutée

N-His

cytochrome

kCAT = 366 s-1

CONCLUSION : le centre [3Fe-4S] est « meilleur » !

Rousset et al. PNAS 1998


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

REMPLACEMENT DU LIGAND HISTIDINE  CYSTEINE

- 350 mV

+ 65 mV

- 350 mV

Forme sauvage

N-His

cytochrome

kCAT = 1050 s-1

- 350 mV

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- 350 mV

+ 65 mV

S-Cys

Forme mutée

cytochrome

kCAT 1 s-1

CONCLUSION : le ligand histidine est essentiel !


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

REMPLACEMENT LIGAND HISTIDINE  GLYCINE

- 350 mV

+ 65 mV

- 350 mV

Forme sauvage

N-His

cytochrome

kCAT = 1050 s-1

- 350 mV

- 350 mV

+ 65 mV

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Forme mutée

Gly

cytochrome

kCAT = 90 s-1

Mais kCAT = 540 s -1 avec 10 mM imidazole !

Confirmation de l’importance du ligand histidine

Dementin et al, JACS 2006


La vie trepidante des electrons dans les enzymes d oxydo reduction patrick bertrand

CONCLUSION (PROVISOIRE)

  • Hydrogénase: le transfert d’électron est limitant dans les formes mutées

    Mais dans la forme sauvage ?

  •  L’efficacité d’une chaîne de transfert d’électron ne dépend

  • pas seulementde l’ordre des potentiels rédox des centres

  • Facteurélectronique ?

  • A suivre…

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