La stringence d’une hybridation entre acides nucléiques 
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La stringence d’une hybridation entre acides nucléiques  : a) A)est influencée par la température du milieu réactionnel b)est influencée par la salinité du milieu réactionnel c)sera dite « élevée » ou « forte » si la concentration en sels est faible

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La stringence d’une hybridation entre acides nucléiques  : a)

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Presentation Transcript


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • La stringence d’une hybridation entre acides nucléiques :a)

  • A)est influencée par la température du milieu réactionnel

  • b)est influencée par la salinité du milieu réactionnel

  • c)sera dite « élevée » ou « forte » si la concentration en sels est faible

  • d)sera plus élevée ou forte si la sonde et les séquences criblées proviennent des espèces différentes

  • Pendant la réplication de l’ADN :

  • les nouvelles chaînes d’ADN commencent toujours avec une amorce d’ARN

  • le brin tardif est constitué par les fragments Okazaki

  • les erreurs sont éliminées par une activité 5’-3’ exonucléase

  • une activité ligase est essentielle

  • La transcription chez les eucaryotes :

  • est l’enchainement des ribonucléotides dans le sens 3’-5’

  • est assurée par une ARN polymérase ARN dépendant

  • est toujours sous le contrôle des facteurs de transcription

  • donne un transcrit primaire qui contient uniquement des exons

  • Dans une cellule eucaryote :

    • Il y a plusieurs ADN polymérases différentes

    • Les ARNm porte une coiffe à l’extrémité

    • La traduction se déroule dans le noyau

    • Les ribosomes se composent de deux sous-unités de 60S et 40S


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • X-gal est un produit chimique:

    • Qui facilite la transformation des bactéries

    • Pour faire la différence entre les plasmides recombinants et non-recombinants

    • Qui donne une résistance aux antibiotiques

    • Qui est métabolisé par l’enzyme Eco R1

  • Les enzymes de restriction :

    • coupent des liaisons hydrogène

    • reconnaissent très souvent des séquences palindromiques

    • sont des protéines

    • reconnaissent toujours les séquences de 6 nucléotides

  • Pendant l’électrophorèse de l’ADN :

    • Les molécules d’ADN sont dénaturées

    • les molécules sont séparées par leur charge

    • les petites molécules migrent plus vite que les grandes molécules

    • les molécules migrent vers le pôle positif

  • Lesquelles des constats suivants sont vrais :

    • La nucléase S1 digère l’ADN et l’ARN

    • Le Klenow a une activité transcriptase inverse

    • Eco R1 reconnait la séquence 3’ GAATTC 5’

    • La ribonucléase H est utilisée pendant la réplication de l’ADN


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Pendant la réaction PCR ( Polymerase Chain reaction):

  • La synthèse de l’ADN est toujours dans le sens 5’-3’

  • A chaque cycle le nombre de chaine d’ADN est doublé

  • On dénature l’ADN à 72°C

  • On utilise les amorces de 9 nucléotides

  • Pendant la traduction d’un ARNm :

  • Le codon d’initiation 5’AUG3’ s’apparie avec la séquence 5’CAU3’ de l’anticodon de l’ARNt

  • Le codon d’initiation AUG se trouve à l’extrémité 5’ de l’ARN

  • La traduction arrête quand la séquence poly A est reconnue par le ribosome

  • Les codons ‘Stop’ sont UAA, UGA et UAG

  • En ce qui concerne l’information génétique dans le noyau d’une cellule humaine :

  • les chromosomes sont tous de la même taille

  • une minorité de l’ADN code les protéines

  • les télomères se trouvent aux extrémités des chromosomes

  • la présence de plus ou de moins de 46 chromosomes est toujours létale

  • Dans une banque ADNc :

  • on trouve uniquement les séquences qui codent des acides aminés

  • les ADNc sont de même taille

  • le nombre de copie d’un ARNm varie selon la transcription du gène correspondant

  • les clones contiennent toujours un site EcoR1


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Les sondes :

  • sont toujours des molécules d’ADN radioactives

  • peuvent être d’ADN ou d’ARN

  • doivent être simple brin pendant l’hybridation

  • peuvent être non-radioactives

  • Dans une banque génomique :

  • on trouve uniquement des séquences qui codent des protéines

  • on trouve des séquences chevauchantes

  • la taille des inserts varie selon la taille des gènes dans le génome

  • les séquences des promoteurs ne sont pas présentes

  • On utilise deux enzymes de restriction différent dans le clonage dans un plasmide pour :

  • être sûr de la digestion de plasmide

  • augmenter les chances de produire des molécules recombinantes

  • avoir un clonage orienté

  • empêcher le plasmide de se re-circulariser

  • Les histones :

  • assurent l’empaquetage de l’ADN chez les eucaryotes et chez les procaryotes

  • contiennent les acides aminés lysine et arginine, qui donnent une charge positive

  • peuvent être modifié par acétylation et méthylation

  • sont des protéines synthétisées dans le noyau


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Cochez la ou les réponses juste(s) :

  • Toutes les cellules dans le corps humain contiennent 46 chromosomes

  • Le chromosome Y détermine le sexe d’un embryon

  • Le transcriptome représente toutes les séquences présentes dans le noyau

  • Les individus avec le syndrome de Down ont un chromosome en moins

  • Un (e) chercheur va synthétiser de l’ADNc avant de le cloner dans un plasmide coupé avec Eco R1. Il /elle veut le cloner utilisant des linkers EcoR1. Il/elle va utiliser les enzymes dans l’ordre suivant pour préparer l’insert :

  • ligase, EcoR1 méthylase, nuclease S1, EcoRI

  • nuclease S1, EcoR1 méthylase, EcoR1, ligase

  • Nucléase S1, EcoR1 méthylase, ligase, EcoR1 

  • ligase, nuclease S1, EcoR1, EcoR1 méthylase

  • Les ARNm chez les cellules eucaryotes :

  • porte un queue poly A à l’extrémité 3’

  • sont transcrits par ARN polymérase II

  • sont lus par le ribosome dans le sens 3’5’

  • ne porte que les séquences codantes


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Un nucléotide A est mis en face d’un nucléotide G par erreur pendant la transcription de l’ADN. Ce changement:

  • a)va toujours donner une protéine avec un seul acide aminé différent

  • b)va forcément changer tous les acides aminés après le changement

  • c)peut n’avoir aucun effet sur les protéines produites par la cellule

  • d)est normalement plus grave quand le nucléotide changé est le troisième dans un codon

  • Soit la portion de séquence du brin non transcrit d'un gène eucaryote …5’ AAT TTT CCG CAT GAA TTACCC 3’… Quelle est la portion de séquence de l'ARN messager correspondant ?

  • a)3’ UUA AAA GGC GUA CUU AAU GGG 5’

  • b)5’ UUA AAA GGC GUA CUU AAU GGG 3’

  • c)5’ AAU UUU CCG CAU GAA UUA CCC 3’

  • d)3’ AAT TTT CCG CAT GAA TTA CCC 5’

  • les nucléosomes :

    • sont des complexes de protéines trouvés chez les eucaryotes

    • assurent un premier niveau de compaction de l’ADN qui s’enroule autour d’un octamère d’histones

    • jouent un rôle dans la régulation de l’expression des gènes

    • sont constitués à partir de quatre protéines de séquences différentes

  • La PCR (Polymerase Chain Reaction) :

  • a)La synthèse de l’ADN est toujours dans le sens 3’5’

  • b)On utilise en général une ADN polymérase qui provient des mitochondries

  • c)Peut être utilisée pour faire une mutagenèse

  • d)On utilise des amorces de petit taille (entre 6 et 9 nucléotides)


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Vous clonez un fragment de 4kb, dont la carte est la suivante :

EcoR1

HindIII

EcoRI

1,5kb

2,5kb

  • au site EcoRI d’un plasmide de 3 kb.

  • Le site multiple de clonage de ce plasmide contient un site HindIII et un site EcoRI. Quels types de fragments vous attendez-vous à obtenir après une digestion du plasmide recombinant avec l’enzyme HindIII :

  • a)des fragments de taille variable car le clonage est non-orienté

  • b)des fragments de 1,5kb et 5,5kb ou 2,5kb et 4,5kb

  • c)un fragment de 7kb

  • d)des fragments de 3kb et de 4kb

  • Pendant l’électrophorèse des molécules d’ADN linéaires sur un gel d’agarose :

  • a)Les molécules les plus petites migrent le plus vite

  • b)Les molécules d’ADN migrent vers le pôle positif

  • c)Les molécules d’ADN migrent vers le pôle négatif

  • d)La séparation des molécules dépend en partie de la durée de l’électrophorèse

  • L’épissage :

  • a)est une étape de la maturation des ARN pré-messagers eucaryotes

  • b)est assuré par l’ARN polymérase I

  • c)se fait dans le cytoplasme après la transcription

  • d)peut être dit « alternatif » et dans ce cas, est un moyen d’obtenir des protéines différentes à partir d’un même gène


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Dans une cellule procaryote on trouve :

  • des ribosomes 70S

  • des mitochondries

  • les introns dans l’ADN

  • l’ARN pol ymérase II

  • Lesquels des constats suivants sont vrais :

  • a)l’ARN polymérase n’est pas impliquée dans la réplication de l’ADN

  • b)l’ARN polymérase possède une activité ‘correction sur épreuves’

  • c)l’ARN polymérase peut commencer sans nécessiter d’amorce

  • d)Les 3 types d’ARN dans une cellule eucaryote son transcrits par des polymérases différentes

  • Les linkers, utilisés pendant le clonage des ADNc sont :

  • a)Méthylés avant leur ligation aux molécules d’ADNc

  • b)De l’ADN double brin

  • c)De l’ADN qui contient un site de restriction

  • d)Sont ajoutés après la méthylation de l’ADNc


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • En ce qui concerne les molécules d’ADN injectées dans le pronoyau mâle pendant la production des souris transgéniques:

  • Elles s’intègrent toujours sur le chromosome X

  • Elles doivent être linéaires

  • Plusieurs copies peuvent être intégrées dans le génome

  • Elles doivent inclure un promoteur pour être exprimées

  • On réalise une expérience de western blot:

  • Lors de l’étape de transfert on réalise un montage en empilant les éléments nécessaires dans l’ordre suivant: 1) électrode positive, 2) papiers imbibés d’électrolyte, 3) membrane de nitrocellulose, 4) gel de protéines, 5) papiers imbibés d’électrolyte, 6) électrode négative

  • On utilise une immunoglobuline appelée HRP qui se lie directement à la protéine que l’on souhaite détecter

  • On utilise un substrat fluorescent (comme par exemple la fluorescéine) qui après action de la HRP sera détectéà l’aide d’un film photographique

  • Il ne faut pas oublier de réaliser un témoin de charge qui permet de connaitre la taille des protéines.

  • Vous cultivez des souches d’E.coli en absence ou en présence de lactose. Vous réalisez une hybridation sur puce à ADN en marquant l’ADNc des bactéries ayant poussé sans lactose par un fluorochrome rouge, les autres par un fluorochrome vert:

  • a)Les spots correspondant aux gènes exprimés qu’en présence de lactose seront colorés en rouge

  • b)Les spots correspondant aux gènes exprimés qu’en absence de lactose seront colorés en vert

  • c)Les spots correspondant aux gènes exprimés dans les deux cas seront colorés en jaune

  • d)Les spots correspondant aux gènes non exprimés seront colorés en jaune


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Lors de la régénération in vitro de plantules à partir de cals:

    • une concentration équivalente de cytokinine et d’auxine entraine la formation d’amas cellulaires indifférenciés

    • on utilise la propriété de totipotence des cellules végétales en culture in vitro

    • en jouant sur les concentrations d’auxine et de cytokinine on peut orienter la différenciation

    • un excès de cytokinines par rapport aux auxines entraine la formation de racines

  • Pour produire des souris knock-out il faut:

  • Injecter l’ADN linéaire dans les cellules ES

  • Des souris mâles vasectomisées

  • Traiter les cellules ES avec de l’ampicilline

  • Faire une sélection avec G418

  • Les plasmides Ti des agrobactéries:

    • Sont simple brin

    • contiennent une région vir portant des gènes essentiels à l’infection

    • sont des petits plasmides inférieurs à 10 kb

    • possèdent des gènes impliqués dans la synthèse des hormones végétales


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Un Southern blot:

  • Permet de détecter la présence d’une séquence d’ARN d’intérêt, par exemple un transcrit, au sein d’un extrait d’ARN totaux

  • Nécessite l’utilisation d’un anticorps primaire spécifique qui est utilisé comme sonde

  • Peut être réaliséà l’aide d’une sonde chaude dont la présence est révélée grâce à un film photographique

  • Comporte une étape de saturation de la membrane de nitrocellulose avec de l’albumine de sérum de bœuf (BSA)

  • La souris est un bon modèle génétique pour les maladies qui touchent l’homme parce que:

  • Elles sont des mammifères

  • Les mutations chez l’homme et la souris donnent toujours le même phénotype

  • L’organisation génomique de l’homme et de la souris est très semblable

  • Les souris ont une reproduction rapide

  • Dans le système de transgénèse végétale, le vecteur binaire est un plasmide:

    • qui porte un site multiple de clonage

    • qui porte des gènes de synthèse d’auxine et de cytokinine

    • qui contient un gène de sélection

    • dépourvu de l’ADN de transfert


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Afin de détecter les virus présents sur des plants de Nicotiana clevelandii cultivés en plein champ, on extrait les acides nucléiques de plantes puis on les hybride avec une puce constituée d'une membrane sur laquelle ont été déposés des oligonucléotides permettant de détecter de nombreux virus à ARN de plantes. Les résultats obtenus après un rinçage à 55°C sont présentés dans la figure 1 ceux obtenus après un rinçage à 65°C sont présentés dans la figure 2.

Figure 1: résultat de l'hybridation des acides nucléiques extraits de plants avec une puce permettant la détection de nombreux virus à ARN (les dépôts d'oligonucléotides sont répétés 3 fois). La température de rinçage après hybridation est de 55°C.

  • Figure 2: résultat de l'hybridation des acides nucléiques extraits de plants avec une puce permettant la détection de nombreux virus à ARN (les dépôts d'oligonucléotides sont répétés 3 fois). La température de rinçage après hybridation est de 65°C.

  • le lavage à 55°C est plus stringent

  • la plante est infectée par deux virus

  • la plante est infectée par trois virus

  • la stringence des lavages est importante pour la spécificité de détection


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Lors de la transgénèse végétale

  • on réalise une co-culture des cellules végétales et d’agrobactéries

  • l’ADN de transfert s’intègre toujours à la même position dans le génome

  • on peut utiliser des antibiotiques

  • on utilise des hormones végétales

  • Dans un Southern blot :

  • la migration par électrophorèse se fait dans des conditions dénaturantes pour empêcher la formation de structures secondaires

  • l’agent dénaturant est l’urée ou le formaldéhyde

  • l’ADN d’intérêt est dénaturé par la soude

  • l’ADN d’intérêt est coupé en petits fragments par sonication (ultrasons)

  • L’épissage, dans les cellules eucaryotes :

  • est un processus nécessaire et indispensable pour la maturation d’un ARN primaire

  • peut entraîner la production de plusieurs protéines à partir d’un même gène

  • se fait en même temps que la transcription

  • requiert des séquences consensus que l’on retrouve dans tous les gènes

  • Le système cre-lox peut-être utilisé pour :

  • effacer un gène/exon dans un seul tissu

  • effacer un gène/exon à un moment donné pendant la vie d’une souris

  • intégrer un gène dans le génome des cellules ES

  • introduire des mutations ponctuelles dans le génome


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Les 2 hormones utilisées pendant la transgenèse sont :

    • l’œstrogène et la progestérone

    • la testosterone

    • les 2 hormones : la Luteinising hormone(LH) et la Follicle Stimulating Hormone(FSH)

    • l’hormonethyroïdienne


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • La technique des puces à ADN est basée sur le principe :

  • de la complémentarité des bases et de l’antiparallélisme entre deux chaines d’ADN

  • de l’interaction de l’ADN avec des anticorps

  • de l’interaction de protéines exprimées avec un anticorps

  • de la complémentarité entre une molécule d’ARN et une protéine

  • Le vecteur binaire est un plasmide :

  • Moins grand que le plasmide Ti

  • possédant un site multiple de clonage

  • possédant des gènes de synthèse d’auxine et de cytokinine

  • qui ne porte pas la région de virulence des plasmides Ti

  • Dans un Northern ou un Southern blot :

  • la stringence de l’hybridation augmente avec la concentration en SDS

  • la stringence de l’hybridation diminue avec la concentration en sel

  • la sonde peut être de l’ARN simple brin radioactif

  • le transfert du gel sur la membrane se fait par électrophorèse

  • Le gène Sry chez la souris :

  • s’exprime juste après la naissance

  • code un facteur de transcription

  • donne une souris mâle quand il s’exprime chez les souris XX

  • se situe uniquement sur le chromosome X


La stringence d une hybridation entre acides nucl iques a

  • Lesquelles des étapes suivantes sont essentiels pour faire une souris knock-out :

  • l’injection des cellules ES dans un blastocyste

  • un traitement des cellules ES avec de l’ampicilline

  • l’introduction du gène Neo dans le génome des cellules ES

  • l’expression du gène de l’élastase

  • Pour transformer les bactéries avec un plasmide il faut :

  • prendre les bactéries en phase exponentielle de croissance

  • mettre les bactéries dans un tampon qui contient du calcium

  • ajouter du X-gal

  • faire un choc thermique à 42°C

  • En utilisant les puces à ADN, il est possible :

  • d’identifier des cellules tumorales

  • d’identifier des microorganismes présents dans l’eau

  • d’étudier les protéines

  • de diagnostiquer des maladies infectieuses

  • Dans un western blot, le SDS sert à :

  • conserver la structure tertiaire des protéines

  • permettre la migration des protéines en fonction de leur taille

  • donner une charge aux protéines en fonction de leur taille

  • couper les protéines qui sont trop grandes


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