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SINTESIS DE PÉPTIDOS en proteómica dirigida PowerPoint PPT Presentation


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SpHPP. SINTESIS DE PÉPTIDOS en proteómica dirigida. Manuel Lombardía Uría. Servicio de Proteómica - Centro Nacional de Biotecnología. Síntesis de péptidos para estudios de proteómica dirigida. Fases:. Selección y diseño de los péptidos para cada proteina de interés:

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SINTESIS DE PÉPTIDOS en proteómica dirigida

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Presentation Transcript


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

SpHPP

SINTESIS DE PÉPTIDOS

en proteómica dirigida

Manuel Lombardía Uría

Servicio de Proteómica - Centro Nacional de Biotecnología


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Síntesis de péptidos para estudios de proteómica dirigida

Fases:

  • Selección y diseño de los péptidos para cada proteina de interés:

    • proceso esencial para el éxito de los experimentos SRM/MRM

    • selección basada en criterios empíricos y teóricos

    • obtención de péptidos proteotípicos óptimos

  • Síntesis química

  • Validación experimental de los péptidos :

    - previa a la síntesis de los péptidos pesados


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Selección de péptidos

Proteínas de interés


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Proteínas asignadas


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Selección de péptidos

Proteínas de interés

Predicción de PTP

Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico”

Evidencia experimental

Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Selección de péptidos

Proteínas de interés

Predicción de PTP

Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico”

Evidencia experimental

Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio

Selección de péptidos


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Criterios de selección de péptidos

  • Únicos para una proteína particular: Búsqueda en Uniprot/Swiss prot (BLAST)

  • 3 a 4 péptidos por proteína

  • No missed cleavages

  • Longitud entre 6 y 20 aa

  • Baja hidrofobicidad: valor de 10 a 40 según algoritmo SSRCalc (sequence specific retention calculator)

  • Evitar aa susceptibles de modificación química

  • - M y W son fácilmente oxidables

  • - N seguida de G ó P tiende a desamidarse

  • - Q y E en N term suelen transformarse en piroglutámico

  • - C en N term tiende a ciclarse si está carbamidometilada

  • - N en N term es dificil de liberar durante la síntesis del péptido

  • - D junto con G, P ó S favorece la rúptura de la cadena a pH bajo

  • - AA ácido en posición P2 ó P2’ promueven missed cleavage


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Selección de péptidos

Proteínas de interés

Predicción de PTP

Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico”

Evidencia experimental

Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio

Selección de péptidos

Búsqueda de evidencias en BD

No todos los péptidos posibles son observados experimentalmente. Seleccionar péptidos más frecuentemente observados en repositorios del tipo GPMDB ó peptide (SRM) atlas


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Selección de péptidos

Proteínas de interés

Predicción de PTP

Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico”

Evidencia experimental

Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio

Selección de péptidos

Búsqueda de evidencias en BD

No todos los péptidos posibles son observados experimentalmente. Seleccionar péptidos más frecuentemente observados en repositorios del tipo GPMDB ó peptide (SRM) atlas

SINTESIS DE PEPTIDOS


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Síntesis de péptidos

  • Aparato: Sintetizador automatizado Multipep de Intavis AG

  • Método: Síntesis en fase sólida (SPPS) sobre resinas de polímeros mediante química FMOC (grupo protector del amino)

  • Formatos: placas 96 minicolumnas con filtro con capacidad para 1-10 µmol

  • Purificación de los péptidos crudos por HPLC semipreparativo

  • Uso de resinas unidas a Lys ó Arg pesadas (13C y 15N) para péptidos pesados

  • Cuantificación de péptidos pesados purificados por análisis de aa ó por

  • espectroscopía fluorescencia (kit comercial)


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Validación de péptidos

Péptidos sintetizados crudos ó purificados

Verificación del péptido por MALDI-TOF MS

Validación mediante experimentos LC-MS/MS y SRM/MRM

Péptidos proteotípicos óptimos

SINTESIS DE PEPTIDOS PESADOS


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Péptido 1 crudo

Péptido 1 purificado


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Péptido 1 crudo

Péptido 1 purificado


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Péptido 3 crudo

Péptido 3 purificado


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Péptido 4 crudo

Péptido 4 purificado


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Péptidos sintetizados


Sintesis de p ptidos en prote mica dirigida

Conclusión

Podemos concluir de estos resultados que nuestro método de síntesis es

apropiado para la producción de un gran número de péptidos en

cantidad y calidad aceptable para su uso en proteómica dirigida.


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