Les sillons de l ’ADN
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Les sillons de l ’ADN. L’ ADN sous forme B. Observer la différence entre le grand sillon le petit sillon Intéressant pour la reconnaissance des protéines. Les sillons de l ’ARN. L’ ARN sous forme A. le petit sillon le grand sillon. Large et peu profond. Étroit et profond.

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Les sillons de l ’ADN

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Presentation Transcript


Les sillons de l adn

Les sillons de l ’ADN

L’ ADN sous forme B

Observer la différence entre

le grand sillon

le petit sillon

Intéressant pour la reconnaissance

des protéines

Pr. Jacques PAOLETTI

SC-L3BH-01


Les sillons de l adn

Les sillons de l ’ARN

L’ ARN sous forme A

le petit sillon

le grand sillon

Large et peu profond

Étroit et profond

donc propriétés de reconnaissance

complètement différentes de celles de l’ADN.

Pr. Jacques PAOLETTI

SC-L3BH-01


Les sillons de l adn

34Å

3,4Å

Caractéristiques des formes canoniques A et B des AN

Forme B

Pr. Jacques PAOLETTI

SC-L3BH-01


Les sillons de l adn

Plan du cours : première partie

A : rappels sur le génome

Les acides nucléiques

Le DNA circulaire

La chromatine

B: Les outils de la biologie moléculaire

Enzymes qui coupent les acides nucléiques

Enzymes qui changent les contraintes des AN

Enzymes qui travaillent sur les phosphates

Enzymes qui recopient les acides nucléiques

C: Les techniques de la biologie moléculaire

Purification des acides nucléiques

Electrophorèse sur gel

Méthode de transfert d’après Southern

Technique de l’amplification génique

Le séquençage de l’ADN

Pr. Jacques PAOLETTI

SC-L3BH-01


L adn circulaire

L’ADN Circulaire

Une forme particulière de l’ADN

l’ADN circulaire

Définition

Sens des super enroulements

Notion de topoisomères

Importance des ADN circulaires

Pr. Jacques PAOLETTI

SC-L3BH-01


Les sillons de l adn

3’

5’

5’

3’

Molécule d’ADN circulaire

La chaine d’ADN peut ce circulariser et chaque brin se refermer sur lui même par des liaisons phosphodiester

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

LE SUPERENROULEMENT POSITIF

Pr. Jacques PAOLETTI

SC-L3BH-01


Les sillons de l adn

LE SUPERENROULEMENT NÉGATIF

Pr. Jacques PAOLETTI

SC-L3BH-01


Les sillons de l adn

LE SUPERENROULEMENT

POSITIF

Pr. Jacques PAOLETTI

SC-L3BH-01


Les sillons de l adn

LE SUPERENROULEMENT

NÉGATIF

Pr. Jacques PAOLETTI

SC-L3BH-01


Les sillons de l adn

ADN circulaire : topoisomères

Pr. Jacques PAOLETTI

SC-L3BH-01


Les sillons de l adn

Topoisomères de l’ADN circulaire

Relaxée

Torsadée

Super torsadée

Pr. Jacques PAOLETTI

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La chromatine

La structure de l’ADN dans la cellule

la chromatine

Pourquoi compacter l’ADN dans la cellule ?

La machinerie de compaction

Les histones

Le nucléosome

Les superstructures de l’ADN

La Chromatine

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Compaction de l’ADN

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Modèle de compaction de l’ADN

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Compactions de l ’ADN

Double hélice d’ADN + histones

Double hélice d ’ADN

Chromatide

Chromosome

Fibre de

chromatine

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

LE NUCLÉOSOME

  • - Comprend de l'ADN (environ 200 pb)

  • Des protéines :

  • des histones sous forme d'octamères:

  • 2 x H2A, 2 x H2B, 2 x H3 et 2 x H4

  • et des protéines non histones.

  • - La protéine histone H1 est extérieure à la partie

  • principale du nucléosome. Elle est sous forme

  • d'une protéine unique.

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Le nucléosome

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

LE NUCLÉOSOME

Histone H1

200 pb d'ADN

Histones : 2 X H2A, 2 X H2B, 2 X H3 et 2 X H4

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Empaquetage de l’ADN

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Chromosomes humains

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les outils de la biologie mol culaire

Enzymes qui coupent les acides nucléiques

Enzymes qui changent les contraintes des AN

Enzymes qui travaillent sur les phosphates

Enzymes qui recopient les acides nucléiques

Les outils de la biologie moléculaire

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

C

A

G

3’

3’

3’

P

P

P

P

5’

5’

5’

Polarité de la chaîne d’ADN

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les nucl ases

Les nucléases

Les enzymes de restriction

La DNase I

La nucléase S1

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les enzymes de restriction

Les enzymes de restriction

Définition

Le palindrome

Symétrie de la coupure

Coupure à bouts collants

Coupure à bouts francs

Restriction et méthylation de l’ADN

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Les enzymes de restriction

Les enzymes de restriction sont des outils utilisés pour couper l’ADN.

La coupure de l’ADN se fait en un site particulier reconnu par l’enzyme.

Chaque enzyme reconnaît une séquence d’ADN qui lui est spécifique.

Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases

c’est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre

deux nucléotides à l’intérieur d’un acide nucléique

Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la molécule d’ADN

à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’).

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Enzymes de restriction

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

LAVAL

Mot palindromique

5’- GAATTC -3’

3’- CTTAAG -5’

Séquence palindromique

Palindrome

Les séquences de nucléotides

Reconnues par les enzymes de

restriction sont habituellement

des séquences dites palindromiques.

Les séquences palindromiques sont

des séquences où la succession des

nucléotides lue dans le sens 5’3’

(gauche - droite) pour le premier brin

est identique à la séquence

lue dans le sens droite - gauche pour

le second brin (sens 5’3’).

Ces séquences palindromiques sont

le plus souvent constituées de 4

ou 6 paires de bases.

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Sites de restriction

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Symétrie des enzymes de restriction

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

LES COUPURES À BOUTS COLLANTS

Enzyme Eco RI :

5'-G ê A A T T C -3'

3'-C T T A A é G -5'

5’ – G – 3’OH 5’P – AATTC – 3’

3’ –CTAAG– 5’P 3’OH – G – 5’

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

LES COUPURES À BOUTS FRANCS

Enzyme Hae III :

5'-G G ê C C - 3'

3'-C C é G G - 5‘

5’ – GG – 3’OH 5’P – CC – 3’

3’ – CC – 5’P 3’OH – GG – 3’

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

MÉTHYLATION DES CYTOSINES

Enzyme Msp I :Coupure

5'-C ê C* G G - 3'

3'-G G C* é C- 5'

Enzyme Hpa II :Pas de coupure

5'-C C* G G - 3'

3'-G G C* C- 5'

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

MÉTHYLATION DES SITES DE RESTRICTION

Enzyme Hind III : coupure par l'enzyme.5'-Aê A G C T T -3'

3'-T T C G Aé A -5‘

Enzyme Hind III (avec hémi-méthylation sur

l'adénine en N6) : Absence de coupure par Hind III.5'-A*A G C T T -3'

3'-T T C G A A -5'

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

LA DNase I

5'3'

3'5'

C'est une endonucléase

Ses coupures se font au hasard

Elle coupe l'ADN (simple ou double brin)

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

P

P

P

P

P

3’

P

P

P

P

P

5’

La DNase

La DNase 1 est une endonucléase qui dégrade

l’ADN double brin ou simple brin.

Les coupures (« nicks ») sont complètement

aléatoires sans spécificité de site.

Les produits de la réaction sont des oligonucléotides

qui possèdent un groupement phosphate en 5’.

L’activité dépend des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+)

OH

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

S1

La Nucléase S1

La nucléase S1 dégrade l’ADN simple brin.

Nettoie les extrémités simples brins.

Coupe un misappariement

Sans activité sur le double brin « parfait »

Sans activité sur les hybrides ADN/ARN

5’

3’

5’

3’

Pr. Jacques PAOLETTI

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Enzymes des phosphates

Enzymes des phosphates

Les phosphatases

Les kinases

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

A

γ

α

β

Phosphatases et Kinases

Les phosphatases sont des enzymes qui enlèvent

les groupements phosphates situés en 5’ d’une

chaîne d’ADN.

Phosphatase alcaline est active à pH basique.

Les kinases, à l’inverse des phosphatases, sont des

enzymes qui ajoutent un groupement phosphate à

l’extrèmité 5’ d’un ADN , en présence d’ATP.

C’est le phosphate en γ de l’ATP qui est transféré.

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Enzymes recopiant les acides nucléiques

Enzymes recopiant l’ADN ou l’ARN

DNA polymérase DNA dépendante

DNA polymérase RNA dépendante

RNA polymérase DNA dépendante

RNA polymérase RNA dépendante

Ces enzymes synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’ -> 3’

La synthèse se fait de manière complémentaire et antiparallèle.

L’enzyme fonctionne en présence de nucléosides triphosphates

(XTP) ou de désoxynucléosides (dXTP)

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les dna polym rases

Les DNA polymérases

Propriétés

DNA polymérase DNA dépendante

DNA polymérase I : Activités exonucléasiques

Fragment de Klenow

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

LES ADN POLYMÉRASES

- Un brin d'ADN matrice

- Une amorce oligonucléotidique

- Une synthèse du brin nouveau 5'è 3'

3'(OH)5'

5'3'

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

DNA polymérase DNA dépendante

Ces enzymes recopient l’ADN en ADN.

Elles nécessitent une amorce d’acide nucléique.

La réaction catalysée est:

(dXMP)n + dXTP  (dNMP)n+1 + PPi

Amorce avec une extrémité 3’-OH libre

La nouvelle chaîne est synthétisée dans

le sens 5’  3’

Règle de complémentarité et de polarité inverse

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

La DNA polymérase 1

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Fragment de KLENOW

Le fragment de Klenow est préparé à partir de la DNA polymérse 1 d’E.coli.

Ce fragment ne possède plus d’activité exonucléasique 5’ 3’ mais garde

l’activité polymérasique et l’activité exonucléasique 3’  5’.

Cette enzyme est utilisée au laboratoire car elle permet de contrôler si la base

qui vient d’être ajoutée obéit à la règle de complémentarité.

(fonction d’édition)

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

LES ARN POLYMÉRASES

- Synthèse d'ARN sans amorce préalable.

- Présence de nucléotides : NTPs et d'ions

magnésium (Mg2+).

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

- Une synthèse du brin nouveau dans le

sens 5'è 3'.

- Absence de fonction d'édition.

- Nécessité de reconnaître le promoteur

spécifique correspondant.

Pr. Jacques PAOLETTI

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Les sillons de l adn

Pr. Jacques PAOLETTI

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