Solunum Yolu nun Primer Hücre Kültürleri

1. Solunum Yolunun Primer Hücre Kültürleri Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: bayram@gantep.edu.tr Toraks 10.Yıllık Kongresi, Antalya 25-29 Nisan 2007

2. Amaç • Solunum yolunun primer hücre kültürleri hakkında bilgi sahibi olma • Solunum yolu hücre kültürlerinin araştırmalarda kullanımı ve sağladığı olanaklar hakkında bilgi sahibi olma • Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme

3. İçerik • Neden primer hücre kültürleri; kullanımı, avantajları • Nelere ihtiyaç duyulur? • Düz kas hücreleri • Fibroblast kültürleri • Alveolar epitel hücreleri • Bronş epitel hücreleri

4. Primer Hava Yolu Hücre Kültürleri – Olanaklar • İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik sorunları • Uygun çalışma modeli • Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb • Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser • Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel irritanlar (hava kirliliği), biomas • Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, 2-agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs

5. Primer Hücreler-Avantajlar • İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik benzerlik • Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde edilebilirler

6. Primer Hücre Kültürü-Dezavantajlar • Elde edilmeleri daha zor • Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar • Etik sorunlar

7. Primer Hava Yolu Hücreleri Nasıl Elde Edilirler?

8. Biyogüvenlik Kabini

9. CO2 İnkübatörü • %5 CO2 • 37 °C • Nemlendirilmiş ortam

10. Hücre Kültür Kapları Hücre Kültür ‘Flask’ı

11. Hücre Kültürü Vasatı

12. Doku-Hücre Kaynağı • Hayvan • İnsan

13. Doku - Hücre Kaynağı • Cerrahi eksplant • Pnömonektomi, Lobektomi • Transplant akciğeri • Biyopsi • Fırçalama (epitel hücreler) • Enzimatik digestion, • Disseksiyon • Hazır, ticari olarak

14. Hava Yolu Düz Kas Hücreleri

15. Hava Yolu Düz Kas Hücreleri-1 • Trakea veya bronş halkalarından • Diseksiyon ile düz kas ayrıştırılır, temizlenir, • 1mm3 parçalara ayrılır • Kültür kapları/flasklara konur - Hirst SJ, Eur Respir J 1996; 9:808-820. - Xie S, et al Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2005; 288: L68-L76.

16. Hava Yolu Düz Kas Hücreleri-2 • Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), %10 fetal buzağı serumu (FCS), L-glutamin, sodium pyruvate,anti-mikrobial ajan • Trypsin ile yerlerinden ayrılır • Kültür kaplarına transfer - Hirst SJ, Eur Respir J 1996; 9:808-820 - Xie S, et al Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2005; 288: L68-L76.

17. Hava Yolu Fibroblast Kültürleri

18. Fibroblast Kültürleri • Lobektomi veya pnömonektomi eksplantı • Tümorsüz doku 3-5mm parçacıklara ayrılır • %10 FCS ile kaplanan flasklara konur • Flask yüzeyini kaplayan hücreler tripsin ile yerlerinden ayrılarak ileri pasajlar elde edilir. - Eickelberg O, et al. Am J Physiol 1999; 276: L814–L824.

19. Alveol Epitel Hücre Kültürleri Alveol epitel Hücreleri ( Tip I ) Bazal membran Alveol epitel Hücreleri ( TipII )

20. Alveol Epitel Hücre Kültürleri-1 • Konsolide olmayan, hemoraji gelişmeyen AC eksplantı • Pulm. Arter PBS ile infüzyon • Distal hava yollarına elastaz içeren HBSS • Akciğer DNAse ve FCS varlığında kıyılır • Hücreden zengin fraksiyon ayrılır • Santrifüje edilir -Fang X, et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006; 290: L242–L249.

21. Alveol Epitel Hücre Kültürleri-2 • Tip 2 pnömosit ve alveolar makrofajdan oluşan bant toplanır • Santrifüj edilir • Anti-CD14 ile kaplı manyetik bilyeler ile inkübe edilir • Manyetik bilyeler, mıknatıs ile ayıklanır • Kalan hücreler inkübe edilir -Fang X, et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006; 290: L242–L249.

22. Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri • Fırçalama, • Enzimatik digestion, • Disseksiyon

23. Bronş Epitel Hücreleri-FIRÇALAMA • Bronkoskopi ile taze hücreler alınır • Kollajen ile kaplı kültür flasklarına alınır • Serumsuz, hormonla zenginleştirilmiş bronşiyal epitelyum büyüme vasatı • Antibiyotikli ortamda • 37 °C, %5 CO2’li, nemlendirilmiş ortamda inkübasyon Bucchieri, F et al, Am. J. Respir. Crit. Care Med.2001

24. Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu

25. Kültür Vasatı • ‘Medium 199’ • Foetal bovine serum (2.5ml) • 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 g/ml) • 1ml human transferrin (2.5 g/ml) • 1ml epidermal growth factor (20g/ml) • 1ml hydrocortisone (0.36 g/ml) • 1ml L-glutamine (0.02mg/ml) • 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon • 100ml tamamlanır ve 0.2m por çap filtreden geçirilir

26. Kültür Kapları 6cm çaplı, Falcon ‘Primaria®’’ plastik kültür kapı (Becton Dickinson,UK) 9mm çaplı 24 gözlü, 0.45m por çaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı

27. Doku eksplantından çoğalan hücreler (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)

28. Deneye hazır 2-3 haftalık kültürler (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)

29. Hücrelerin Elektron Mikroskobik Görünümü M M D S S D x56,000 x30,000

30. Hücrelerin DEP ile İnkübasyon

31. Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi

32. DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi Bayram H, et al. Am J Respir CellMol Biol 1998.

33. Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronş epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı pg/g selüler protein Non-ast. Ast. p<0.05 (log.) p<0.003 p<0.002 YK IL-8 GM-CSF RANTES sICAM-1 Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.

34. DEP ile 24s inkübasyondan sonra non-astmatik ve astmatik bronş epitel hücrelerinden IL-8 salınımı Non-asthmatics Asthmatics Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.

35. İn vitro Ozon –NO2 Maruziyet Düzeneği NO2 %5 CO2 İn Air

36. Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği

37. Ozon ve NO2’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronşepitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.

38. Ozon ve NO2’e 6s maruziyetin astmatik bronş epitel hücrelerinden GM-CSF salınımına etkisi Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 2001.

39. Loratadinin 400ppb NO2’nun Bronş EpitelHücrelerinden Yol Açtığı IL-8 Salınımına Etkisi Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1999.

40. Özet • Solunum yolunun primer hücre kültürleri laboratuar ortamında elde edilebilir • Solunum yolu hücrelerinin fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri araştırılabilir • Hastalıkların patogenezinin aydınlatılmasında yararlanılabilir • Toksik ajanların etkileri araştırılabilir • Terapötik ajanların etkileri araştırılabilir

41. Yorum • Bütün dünyanın yaygın olarak kullandığı hava yolu hücre kültürü olanaklarından Türkiye’deki araştırmacılar da yararlanmalıdır

42. Teşekkür St Bartholomew’s and The Royal London School of Medicine and Dentistry • Prof RJ Davies • Dr JL Devalia • RJ Sapsford • Dr OA Khair • Dr MA Abdelaziz • Dr C Rusznak Dicle Universitesi

43. Sabrınız İçin Teşekkür Ederim