אנזימים

1. אנזימים

2. מצגת זו כוללת את הנושאים הבאים: • השפעת הטמפ' על פעילות אנזימטית. • השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית. • השפעת מעכבים על פעילות אנזימטית.

3. בדיקת קצב פעילות אנזים ניתן לבדוק קצב פעילות אנזים בדרכים שונות: • לפי- ריכוז התוצר שנוצר ביח' זמן. • לפי- כמה מצע התפרק ביח' זמן. השפעת טמפ' על פעילות אנזימטית

4. בדיקה ישירה ובדיקה עקיפה בדיקה בשיטת הספקטרופוטומטריה: שיטה זו מבוססת על כך שלתוצר יש בליעה אופיינית באורך גל מסויים, שאינה קיימת למגיב. עליה בבליעה של האור ע"י התוצר הוא ביחס ישר לריכוז התוצר. יתרונות: • נוחיות הבדיקה • מקבלים מידע על קצב מהלך התגובה זוהי בדיקה ישירה השפעת טמפ' על פעילות אנזימטית

5. בדיקה ישירה ובדיקה עקיפה • במידה ולתוצר אין בליעה שניתנת למדידה, יש להוסיף ריאגנט בעל צבע שיגיב עם התוצר ואותו לבדוק בספקטרופוטומטר. זוהי בדיקה עקיפה השפעת טמפ' על פעילות אנזימטית

6. חסרון השיטה העקיפה החסרון בשיטה זו שהיא אינה ישירה וחייבים לבצע אותה בשני שלבים: • בשלב ראשון – מגיבים את המצע עם האנזים לפרק זמן מסויים ואז מפסיקים את התגובה. • בשלב שני – מבצעים תגובה עם התוצר (ריאגנט צבע למשל) ורק אז בודקים בליעה בספקטרופוטומטר. • סירבול הבדיקה • לא ניתן לדעת מה מתרחש במהלך התגובה השפעת טמפ' על פעילות אנזימטית

7. הביקורות הנדרשות לבדיקה אנזימטית • מצע בלבד – כי קיים פירוק טבעי של המצע. • אנזים בלבד – כי יתכן ולאנזים יש בליעה בפני עצמו. (מבחנת ה Blank). השפעת טמפ' על פעילות אנזימטית

8. ישנם שתי בעיות לגבי השפעת חימום על אנזים: • השפעת טמפ' שונות על פעילות אנזים – התגובה בין E ל S נבדקת בטמפרטורות שונות ומתקבל הגרף הבא Go • יציבות האנזים בטמפ' מסויימת לאורך זמן – במקרה זה ה E ישהה באותה טמפ' (למשל 50 מעלות) לפרקי זמן שונים, ורק אח"כ יועבר למצע, והפעילות תתבצע הכי יעיל בטמפ' האופטימלית שלה- E. השפעת טמפ' על פעילות אנזימטית

9. השפעת טמפ' על פעילות אנזימטית Back

10. השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

11. השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית E + S  ES  P + E התצמיד ES אינו יציב, וקשה מאד להוכיח את קיומו במעבדה. הוא יכול להתפרק בשתי דרכים: • לכוון המצע והאנזים. • לכוון התוצר והאנזים. השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

12. חשיבות למידת המאפיינים הקינטיים של האנזמים: • מנגנון פעולה • שליטה על פעולתם • הערכה כמותית של יעילות אנזים על סוגים שונים של מצע. • השוואה בין איזואנזימים על פעילותם באותו מצע. • הכרת ההשפעה של מולק' מעכבות על הפעילות. השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

14. k1 E + S  ES  P + E k3 k2 מבין שלושת הקבועים שבנוסחה, K3 קטן יחסית ל K1 ו K2 ולכן נחשב כ"צוואר הבקבוק": קצב התגובה בסופו של דבר נקבע לפי K3 (קצב התגובה נקבע תמיד לפי השלב האיטי ביותר) הגרף המתאר השפעת ריכוז המצע [s] על קצב פעילות אנזימטית נקרא גרף מיכאליס מנטן והוא נראה כך: השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

15. השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

16. ניתוח הגרף: ניתן להבחין בגרף זה בשלושה קטעים: • תגובה מסדר ראשון: המהירות V משתנה ביחס ישר לריכוז המצע. 3. תגובה מסדר 0: המהירות V נשארת קבועה למרות העלייה בריכוז המצע. 2. קטע זה הוא תגובת ביינים בין סדר 0 לסדר ראשון: קצב התגובה כאן עולה עם עליה בריכוז אבל לא ביחס ישר. השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

17. הסבר לקטע 3 תגובה מסדר 0: אין מספיק אנזים שיוכל להתקשר למצע שריכוזו הולך ועולה. בשלב מסויים מהווה ריכוז האנזים גורם מגביל במערכת. כל האתרים של האנזים רוויים במצע, ולמעשה מגיעים למקסימום פעילות אנזימטית שאינה עולה למרות עלייה בריכוז המצע. השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

18. משוואת מיכאליס מנטן הסבר המשוואה: V- מהירות התגובה האנזימטית [s] – ריכוז המצע Vmax – קבוע Km – קבוע מיכאליס מנטן השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

19. 2 קיימים שלושה מקרים במשוואה: • S=Km : הוא ריכוז המצע שבו ל V= Vmax • S>>Km: אין מגבלה במצע ולכן האנזים פועל במקסימום פעילות ומהירות התגובה תלויה רק בריכוז ה E ואז V=Vmax.(קטע 3 בגרף) • S<<Km: בריכוזים נמוכים של מצע קיים יחס ישר בין V ל S (קטע 1 בגרף) השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

20. Km הגדרה: • קבוע מיכאליס מנטן הוא ערך קבוע עבור אנזים ומצע מסויימים. ואינו תלוי בריכוז האנזים. • ריכוז המצע שבו פעילות האנזים הוא חצי Vmax. השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

21. משמעות ה Km: • מדד כמותי המבטא את הזיקה בין האנזים לסובסטרט. ככל ש Km עולה הזיקה בין ה E ל S יורדת, כי צריך יותר מצע כדי להגיע ל Vmax . Km נמוך מבטא זיקה טובה, כי יש צורך בפחות מצע כדי להגיע ל Vmax. (קיימים איזואנזימים העובדים על אותו מצע אבל יש להם זיקה שונה למצע. הם מגיעים לאותו Vmax אבל ערך ה Km שלהם שונה). 2 2 השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

22. Km = K2+K3 K1 משמעות ה Km: 2. המשמעות השנייה של Km קשורה בקבועים: • K2 ו K3 הם הקבועים שמבטאים פירוק של התצמיד ES , ולעומתם K1 הוא קבוע שתורם ליצירת התצמיד ES. כאשר ערכו של Km גדול, משמע שערך K2 + K3 גבוה ועולה וK1 נמוך ויורד, כלומר התצמיד ES נוטה יותר להיפרד ולהתפרק מאשר להיווצר – אין זיקה טובה בין ה E ל S. ולהיפך, כאשר Km נמוך, K2 + K3 ערכם קטו וערכו של K1 התצמיד נוטה יותר להיווצר מאשר להתפרק. השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

23. החסרון במשוואת מיכאליס מנטן: מתוך הגרף קשה לדעת בוודאות את הערך של Vmax כי הוא מוגדר עבור ערך אינסופי של S, ובמעבדה קשה להגיע לריכוז מצע אינסופי ומכאן שגם קשה להגיע ל Vmax. לכן גם קשה לחשב את ערך Km. לכן פותחה משוואה שונה מתוך משוואת מיכאליס מנטן. משוואת לינוובר ברק. השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

24. A Lineweaver-Burk plot השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

25. A Lineweaver-Burk plot כאשר מתארים 1\v -1\s מקבלים גרף המתואר ע"י קו ישר. בגרף זה הנקודות שמתקבלות הן הפוכות לאלו שב V-S כי בריכוז נמוך ביותר של סובסטרט ה 1\v הוא הגבוה ביותר. התכונה החשובה ביותר בגרף זה היא שהגרף אינו מתלכד עם נק' ה-0. ולכן נק' ה-0 משמעותה 1\s=0 ואז S הוא אינסופי. לא מגיעים מבחינת הגרף ל- 1\v=o כי אז גם V אינסופי, אבל מכיוון שהקו המתואר בגרף זה הוא לינארי ניתן להמשיך אותו כקו דימיוני והא יחתוך בנק' מסויימת את ציר ה y- ובנקודה נוספת את ציר ה-X . השפעת ריכוז מצע על פעילות אנזימטית

26. מעכבי פעילות אנזים

27. מעכבי פעילות אנזים: • מעכבים בלתי הפיכים: המעכב נקשר לאנזים בקשרים חזקים שקשה לסלק אותם ולכן העיכוב שנגרם לפעילות האנזים הוא בלתי הפיך. • מעכבים הפיכים: הרחקת המעכב מאפשרת לאנזים לחזור לפעילותו המקורית. השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

28. ישנם שלושה סוגי מעכבים: • עיכוב תחרותי – competitive inhibition • עיכוב לא תחרותי - noncompetitive • עיכוב בלתי תחרותי uncompetitive - השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

29. מעכב תחרותי השפעת מעכבים על פעילות אנזים

30. מעכב תחרותי השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

31. מעכב תחרותי מעכבים תחרותיים דומים במיבנם לסובסטרט ומתחרים אתו על הקשירה לאתר הפעיל. בעקבות זאת יש עלייה בערך ה-Km הנמדד בנוכחות מעכב. (מוריד את הזיקה בין ה E ל S). אולם אין שינוי ב Vmax כיוון שבעודף סובסטרט ניתן להתגבר על התחרות עם האנזים. (כי Vmax מוגדר כאשר ריכוז המצע הוא אינסופי). השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

32. Effects of competitive inhibition on enzymekinetics השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

33. מעכב לא תחרותי השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

34. מעכב לא תחרותי השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

35. Effects of noncompetitive inhibition on enzyme kinetics השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

36. מעכב לא תחרותי מעכבים לא תחרותיים נקשרים לאתר רגולטורי השונה מהאתר הפעיל של האנזים. קשירת המעכב אינה מפריעה לקשירת הסובסטרט לאתר הפעיל. ולכן אין השפעה על זיקת האנזים לסובסטרט – Km לא משתנה. אבל, בכל מקרה ש I קשור לאנזים לא מקבלים תוצר, יש עיכוב בפעילות ולכן Vmax יורד. השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

37. הערה.. בכרומטוגרפיה זיקתית ניתן לקשור לעמודה במקום מצע מעכב תחרותי, כי האנזים נקשר גם למעכב תחרותי בגלל הדימיון במבנה הסובסטרט והמעכב. אין סיבה במקרה זה שהאנזים יפעל. יש צורך רק לבדוק את תנאי הניתוק מהעמודה. השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

38. מעכב בלתי תחרותי השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

39. מעכב בלתי תחרותי מעכב בלתי תחרותי מעדיף להקשר לתצמיד [ES] מאשר לאנזים החופשי. ולכן מתוך התרשים רואים כי קשירת מעכב זה דווקא מעלה את K1 בעוד ש K2 יורד. לכן הערך Km , בנוכחות מעכב זה, יורד וקטן אף הוא. כלומר, הזיקה בין ה E ל S טובה יותר. K3 קטן במקרה זה ולכן Vmax יורד. השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

40. השפעת מעכבי ם על קצב תגובה אנזימטית

41. השפעת ריכוז האנזים [E] על קצב התגובה האנזימטית

42. השפעת ריכוז אנזים [E] ההשפעה נמדדת בדר"כ בריכוז מצע גבוה. כלומר, אין הגבלה של ריכוז המצע. אבל כיוון שמדובר בריכוז מצע אינסופי E הוא בעצם ES במצב זה כל האתרים של האנזימים רוויים במצע. Vmax - מתאר את פעילות האנזים בריכוז מצע אינסופי. משתנה בהתאמה לריכוז הסובסטרט K3 - מתאר את פעילות האנזים עבור מול אחד של אנזים. Vmax= k3[E] השפעת ריכוז אנזים על פעילות אנזימטית

43. השפעת ריכוז אנזים [E] Km אינו משתנה כאשר משנים את ריכוז האנזים. Km כאמור, נחשב כתכונה של האנזים המבטאת את זיקתו למצע ואינה תלויה בריכוז האנזים. לעומת-זאת שינויים בטמפ' וב PH עשויים להשפיע על המבנה המרחבי של האנזים, ולכן ישפיעו על ה Km שלו. בדר"כ כל שינוי בתנאים האופטימליים יגרמו לעליה ב Km , ובדר"כ יוריד גם את ה Vmax. השפעת ריכוז אנזים על פעילות אנזימטית