Investigación y recuento de Clostridium perfringens

1. Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia Tema 13 Investigación y recuento de Clostridium perfringens Clostridium perfringens, es un bacilo Gram+, bastante grande, de 4-8 x 0,3-1,5 μm. Forma esporas ovales subterminales no deformantes. Tienen capsula, son inmóviles y anaerobios estrictos. Reducen nitratos a nitritos. Producen SH2. Fermentan muy rápidamente la lactosa (con producción de ácido y gas), y glucosa, galactosa, fructosa, maltosa, manitol, inositol y sacarosa. Producen lecitinasa. Se encuentran en suelo y aguas y formando parte de la flora microbiana normal del tubo digestivo de animales y hombre. Es un microorganismo patógeno para animales y el hombre. Produce varios tipos de toxinas según las cuales se clasifican en varios tipos: A,B,C,D y E. El tipo A produce una enterotoxina causante de intoxicación alimentaria, el tipo B es el causante de la gangrena gaseosa, el tipo C es el causante de la enteritis necrotizante y los tipos D y E no son patógenos. La enterotoxina es ternolabil y se produce durante la fase de transición de las células vegetativas a esporas y se libera cuando las esporas están formadas. Las condiciones alcalinas del intestino delgado favorecen la esporulación. La toxina se fija a unos receptores de las células con borde en capillo del intestino delgado alterando la permeabilidad de la membrana, ocasionando pérdida de líquidos. Síntomas: tras un periodo de incubación corto, (8-24h) aparece una diarrea acuosa con espasmos abdominales sin fiebre nauseas ni vómitos. No es grave u dura unas 24h.

2. Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia Suspension madre 1:10 TW 10 ml 10-1 10-2 10-4 10-5 10-3 1 ml Medio TSN Cultivo en anaerobiosis 46ºC 24-48 h Lactosa + Gas + Pruebas confirmativas Movilidad - Colonias negras rodeadas de un halo blanco por la acción de la lecitinasa Tema 13 Investigación y recuento de Clostridium perfringens Técnica en tubos Técnica en tubos Agar triptona sulfito neomicina (Tryptone Sulphite Neomicin: TSN) Peptona de caseína 15 g Extracto de levadura 10 g Sulfito sódico 1 g Citrato de hierro 0,50 g Sulfato de polimixina B 0,02 g Sulfato de neomicina 0,005 g Agar 14 g Agua destilada 1.000 ml

3. Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia Técnica en placas Suspension madre 1:10 TW 10 ml 10-1 10-2 10-4 10-5 10-3 Cultivo en anaerobiosis46ºC 24-48 h Medio TSN 1 ml Pruebas confirmativas Lactosa + Gas + Movilidad - Colonias negras rodeadas de un halo blanco por la acción de la lecitinasa Tema 13 Investigación y recuento de Clostridium perfringens Agar triptona sulfito neomicina (Tryptone Sulphite Neomicin: TSN) Peptona de caseína 15 g Extracto de levadura 10 g Sulfito sódico 1 g Citrato de hierro 0,50 g Sulfato de polimixina B 0,02 g Sulfato de neomicina 0,005 g Agar 14 g Agua destilada 1.000 ml

4. Tema 13 Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia Agar TSCY Agar LYL Lactosa + Gas + Movilidad - Medio para Clostridium reforzado (Reinforced Ciostridial Medium:RCM) Extracto de levadura 3g Extracto de carne 10 g Peptona 10g Dextrosa 5g Almidón soluble 1 g Cloruro sódico 5 g Acetato sódico 3 g Clorhidrato de cisteína 0,50 g Agar 15 g Agua destilada 1.000 ml Añadir 100μl de Neomicina por ml de medio Investigación y recuento de Clostridium perfringens Técnica en medio líquido. NMP Suspension madre TW 1 ml 1 ml 1 ml Agar-lactosa-leche-yema de huevo (LYL) Ext. Carne 10g Lactosa 12 g Rojo neutro (10 g/1) 0,03g Tioglicolato sódico 0,12g Agar 15 g Agua destilada 1.000 ml Añadir 15 ml de emulsión de yema de huevo y 25 ml de leche desnatada a 825 ml de medio base. 10-1 10-2 10-3 Colonias negras rodeadas de un halo blanco por la acción de la lecitinasa Caldo Clostridio Reforzado RCM Pruebas confirmativas Triptosa-Sulfíto-Cicloserina con Yema de huevo (TSCY) Triptosa 15 g Soja 5 g Extracto de levadura 5 g Metabisulfito sódico 1 g Citrato férrico amónico 1 g Agar 20 g Agua destilada 1.000 ml Añadir 4 ml de Cicloserina al 1% y 6 ml de emulsiçon de yrma de huevopor cada 90 ml de medio Incubación 46ºC, 24 h. Lectura en tablas NMP Incubación 46ºC, 24 h.

5. Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia Tema 14 Investigación de estreptococos fecales Son microorganismos de forma cocoide que se agrupa en parejas o en cadenas. Son, generalmente, inmóviles, no esporulados, Gram + y catalasa-negativos, microaerófilos o anaerobios facultativos. De acuerdo con el esquema de Lancefield, se agrupan antigénicamente mediante las letras A, B, C, D, etc. Al grupo D de Lancefield pertenecen los estreptococos fecales, por ser su hábitat normal el tubo digestivo de animales de sangre caliente. Entre sus características peculiares, está el poder crecer a temperatura de 45ºC y en medios con 4% de bilis. Los estreptococos fecales, agrupan a Streptococcus faecalis y sus variedades Str. faecium y Str. duran que viven generalmente en el intestino humano. Otros estreptococos fecales viven en los animales como Str. equis y Str. bovis. Recientemente este grupo de microorganismos que se denominaban enterococos se han separado en un genero nuevo denominado Enterococcus. En si no se les considera patógenos pero si se les ha relacionado con algunos procesos diarreicos y de vómitos que aparecen entre 2-30 horas de consumido el alimento y duran unas pocas horas. Los estreptococos son importantes por ser considerados indicadores de contaminación fecal, y su presencia en los alimentos indica falta de higiene o condiciones de conservación defectuosas, excepto en alimentos en los que interviene como flora habitual de procesos fermentativos.

6. Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia Suspension madre 1:10 TW 1 ml PCA 9 ml caldo KAA Incubación 37ºC, 24h Tubos + : negros por hidrólisis de la esculina 0,1 ml Incubación 37ºC, 24h Agar KAA Colonias típicas Incubación 37ºC, 24h Pruebas identificación Tinción Gram Crecimiento 45ºC Crecimiento 6,5% ClNa Esculina bilis Tema 14 Investigación de estreptococos fecales Método de Presencia - Ausencia Colonias pequeñas con un halo negro alrededor por hidrólisis de la esculina KAA Kanamicina-Aesculina-Azida Triptona 20 g Extracto de levadura 5 g Cloruro sódico 5 g Citrato sódico 1 g Esculina 1 g Citrato férrico amónico 0,50 g Azida sódica 0,15 g Sulfato de kanamicina 0,02 g Agua destilada 1.000 m

7. Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia Método en Medio Líquido NMP Suspension madre 1:10 TW 1 ml 1 ml 1 ml 10-1 10-2 10-3 PCA 9 ml caldo KAA Incubación 37ºC, 24h 0,1 ml Agar KAA Incubación 37ºC, 24h Colonias típicas Pruebas identificación Tinción Gram Crecimiento 45ºC Crecimiento 6,5% ClNa Esculina bilis Tema 14 Investigación de estreptococos fecales Colonias pequeñas con un halo negro alrededor por hidrólisis de la esculina KAA Kanamicina-Aesculina-Azida Triptona 20 g Extracto de levadura 5 g Cloruro sódico 5 g Citrato sódico 1 g Esculina 1 g Citrato férrico amónico 0,50 g Azida sódica 0,15 g Sulfato de kanamicina 0,02 g Agua destilada 1.000 m

8. Dra. M. L. Ortiz. Dep. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia Pruebas identificación Tinción Gram Crecimiento 45ºC Crecimiento 6,5% ClNa Esculina bilis Colonias pequeñas y de color rojo por la reducción del TTC a Formazano, de color rojo Tema 14 Caldo de Litsky Peptona 20 g Glucosa 5 g Cloruro sódico 5g Hidrógeno fosfato dipotásic 2,70g Dihidrógeno fosfato potásico 2,70g Azida sódica 0,30 g Violeta de etilo 0,0005 g Agua destilada 1.000 ml Investigación de estreptococos fecales Caldo de Rhote simple Peptona 20 g Glucosa 5 g Cloruro sódico 5 g Hidrógeno fosfato dipotásico 2,70 g Dihidrógeno fosfato potásico 2,70 gAzida sádica 0,20 g Agua destilada 1.000 ml Método empleado en el análisis de aguas Estreptometria Suspension madre 1:10 TW Medio de Barnes al trifenil tetrazolio Peptona 10 g Extracto de carne 10 g Glucosa 10 g Agar 15 g Agua destilada 1.000 ml Añadir 5 ml de Cloruro de Trifenil Tetrazolio al 0,2% y 5 ml de Acetato de Talio al 2% 9 ml caldo Rhote Tubos +: turbidez Incubar 37ºC, 24h 9 ml Caldo Litsky Incubar 37ºC, 24h Tubos +: turbidez, a veces se forma un depósito violeta en el fondo Agar KF Barnes Incubar 37ºC, 24h Colonias típicas