Az immunoesszék érzékenysége

1. Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.) Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek (ELISA)MHC tipizálásHiperszenzitivitási reakciók (a diasorhoz tartoznak a FIG4(T-APC).MPG (998KB) és a pro5.exe (4414KB) animációkat tartalmazó fájlok)

2. Az immunoesszék érzékenysége

3. A T- és B-limfociták funkcionális aktivitásának mérése Témák: • A T- és B-sejtek poliklonális aktivációja a TCR vagy a BCR • nem antigén-specifikus aktivációjával • lektinek által indukált aktiváció • α-IgM, α-CD3 vagy α-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció • (korai aktiváció: intracelluláris események vizsgálata) 2. Az aktivációt követő T- és B-sejt válasz jellemzése aktivációs markerek proliferatív válasz 3H-timidin beépülés CFSE fluoreszcencia feleződés sejtciklus vizsgálata Ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, CBA) 3. Az aktivált T- és B-sejtek számának meghatározása az antigén hatás után ELISPOT Intracelluláris citokin festés Pentamer (vagy tetramer) technika

4. A humorális immunválasz szakaszai felismerés aktiváció, proliferáció, differenciáció Antitest termelés Segítő T-sejt, más stimulus Klonális expanzió IgG-t expresszáló B-sejt Izotípus váltás Antigén Nyugvó IgM+, IgD+ érett B-sejt Aktivált B-sejt Affinitás érés Nagy affinitású IgG Nagy affinitású Ig-t expresszáló B-sejt Memória B-sejt

5. A T-sejt válasz szakaszai Aktiváció Klonális expanzió Antigén felismerés Differenciáció Effektor funkciók Makrofágok, B-sejtek, más sejtek aktivációja Naív CD4+ T-sejt CD4+ Effektor T-sejt Citokinek (pl. IL-2) CD4+ Memória T-sejt Fertőzött target sejtek ölése, makrofág aktiváció Naív CD8+ T-sejt Citokinek (pl. IL-2) CD8+ Effektor T-sejt (CTL) CD8+ Memória T-sejt Nyirokszervek Perifériás szövetek

6. B-sejt receptor komplex általi jelátvitel Membrán Ig keresztkötése antigénnel Tirozin foszforiláció PLC aktiváció GTP/GDP csere a Ras-on, Rac-on Biokémiai intermedierek Emelkedett ic Ca2+ Diacilglicerol Aktív enzimek Ca2+ dependens enzimek Transzkripciós faktorok

7. T-sejt receptor komplex általi jelátvitel T sejt Adapter fehérjék TCR mediált jelek indítása GTP/GDP csere a Ras-on PLC1 aktiváció Biokémiai intermedierek Diacilglicerol Emelkedett ic Ca2+ Késői jelátvitel enzimei kalcineurin MAP kinázok Transzkripciós faktorok Az áttekintett folyamatok többségelépéseiben vizsgálható

8. Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki. Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi. Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata.

9. A limfociták poliklonális aktivációja LPS, lektinek, PMA+Ionomycin jelenlétében T-sejt B-sejt (egér) T-sejt TLR4 Az Ionomycin a külső Ca2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA-val A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. LPS a TLR4-en keresztül aktiválja a sejteket BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák

11. Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) - FRET foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) ic Ca2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis - IC citometria • ELISA, ELISPOT • Bioassay Citokin szekréció - DNS tartalom - IN antigének Sejtciklusba lépés/apoptózis A limfociták aktivációjának főbb folyamatai, és azok vizsgálata Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTT Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

12. A jelenlevő vagy termelt „antigének” (fehérjék, citokinek, ellenanyagok, ….) vizsgálata

13. ELISA Enzyme Linked ImmuneSorbent Assay ELISA plate (lemez) lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre

14. enzim enzyme linked immune sorbent felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok ellenanyaghoz konjugált enzim

15. Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

16. Jelzés Szekunder ellenanyagok Jelzés Antigén Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai (szempontok: hatékonyság, érzékenység, kényelem, megbízhatóság, ár) Indirekt módszer Direkt módszer egyszerűség több jel  nagyobb érzékenység Primer ellenanyag Felület

17. Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Enzimek A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyagok Szekunder ellenanyagok Primer ellenanyag Antigén Enzim-antienzim rendszer (leginkább mikroszkópos immunhisztokémiában lehet találkozni vele) PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz

18. Avidin Biotin enzimComplexek (arányok!!! mint a precipitációnál) Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Avidin Biotinált ellenanyag Antigén Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Jel felerősítése

19. Az ELISA rendszerek nem csak a vizsgált anyag jelenlétének a kimutatására, hanem ismert koncentrációjú sztenderdek segítségével a pontos mennyiség meghatározására is alkalmasak A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin rendszereket összekombinálva is használják. Lásd a következő példákat.

20. Bioaktív anyagok kimutatása hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek Tumor antigének kimutatása Citokinek, hormonok kimutatása doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetíciós tesztekkel

21. kombinált „szendvics”ELISA Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvicstechnikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. szérum, liquor, szennyvíz). citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása felesleges konjugátum kimosása A nem kötődő anyagok kimosása felesleges fehérjék kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges ellenanyagok kimosása citokintartalmú minta hozzáadása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

22. Tumordiagnosztika Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Tumor Ag specifikus csapda ellenanyaggal fedett felület (a kit része) • A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában • Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak • Prosztata daganatok • prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hipertrófiás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával. • Hasonlóan használható fel a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

23. Hólyagrák: Az epiteliális sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker Pajzsmirigy daganatok: A szérum tiroglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker Alpha Fetoprotein (AFP) : 68kD-os protein, amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja hepatómával, ovariális-, tesztikuláris- és preszakrális teratokarcinómákkal, de egyéb daganatokkal is összefüggésben lehet. Carcinoembryonic Antigen (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben csak az embrionális fejlődés során van jelen. Colorectálisés egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára. Her-2/neu protein: 185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok 20-30%-ban a tumorsejtek megemelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

24. Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása egyszerű indirekt ELISA lépései Antigén specifikus ellenanyag kimutatásához Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges ellenanyagok kimosása felesleges antigén kimosása felesleges fehérjék kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével specifikus ellenanyagok hozzáadása HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

25. emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak Fertőzések diagnosztikája Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor. • ilyen elven működik: • Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t • HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból vagy akár beszáradt vérfoltból • Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás • A toxoplazmózis terhesség során veszélyes akkor, ha az anya elsődleges fertőzésben szenved. Ekkor IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és ezzel nem nyújtanak védelmet a magzat számára.

26. Autoimmunitás A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják • Pl. • SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb anitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható). • I típusú (autoimmun) diabetesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével: • glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90% -ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene • IA-2 (tirosine foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek 50-75% -ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető. • inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)

27. izotípus specifikus ellenanyag a szérum ellenanyaga ellenanyag capture-ellenanyag Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál). Az így kimutatott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti-izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető. anti-IgM anti-IgG Memória válasz IgM IgG Antigén • Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében • Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma)

28. kompetitív ELISA Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása • Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás A színreakció itt fordított: több oldott antigén = halványabb szín - Kromogén anyagok hozzáadása Gyakran használják kis méretű antigének, vagy haptének esetében. Ha kevés az antigénen a hozzáférhető epitop, a szendvics ELIZÁban lefoglalja ezeket az első „capture” ellenanyag.

29. ELISA alaptípusok (összefoglalás) capture/szendvics egyszerű Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag detektor/reporter ellenanyag Ag specifikus ellenanyag antigén Ag specifikus capture ellenanyag antigén kompetitív Ag specifikus ellenanyag antigén pl. antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához antigének kimutatásához az oldatban jelen van a kimutatandó Ag nincs jelen oldott Ag kis mennyiségű, kis méretű antigén kimutatásához (elég ha ha csak egyféle specifikus ellenanyaggal rendelkezünk)

30. ELISA hibák Aspecifikus kitapadásból eredő hiba Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az • A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: • telítéssel/blokkolással • detergens alkalmazásával hook effect! – nagy koncentráció vagy kevés mosás miatt

31. Elkészült ELISA lemezek

32. Diagnosztikai gyorstesztek: pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak!

33. hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal oldalnézet elölnézet abszorbciós rész (cellulóz, papír) kontroll ellenanyag sáv nitrocellulóz membrán hCG csapda ellenanyag sáv jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter (A jelzés szabad szemmel is látható!) abszorbciós lap, mintafelviteli rész vizeletminta

34. a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok nincs hCG van hCG kontroll sáv teszt sáv kontroll ellenanyag sáv hCG csapda ellenanyag sáv jelölt ellenanyagok Elvben a szendvics ELISÁra hasonlít hCG

35. Ugyanez kompetitív rendszerben nincs hCG van hCG kontroll sáv teszt sáv kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok hCG sáv ( kikötött hCG) A kompetitív ELISA elve hasonló

36. Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre: • kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) • festékkel töltött latex gyöngyök Az eljárás szemikvantitatívá tehető Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei: élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására

37. ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot • Elve hasonlít az ELISA-hoz • Eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtek számának meghatározására szolgált. • Ma alkalmas egyéb szolubilis effektor molekulák, pl. citokinek, kemokinek, granzim termelő sejtek számának meghatározására is. • Egyaránt alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására. • Érzékenység: kb. 1 per 300 000 sejt • Az első lépéseit sejtkultúrában aszeptikus körülmények között végzik.

38. ELISPOT A mérés menete - a capture ellenanyagok kitapasztása - blokkolás - a sejtek hozzáadása (aktiválás, inkubáció) - mosás - biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása (például) - avidin-enzim konjugátum Az ELISPOT lemez egy lukának felülnézete a képződött foltokkal - oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-etilkarbazol) A citokin termlő sejt helyét mutató folt

39. Leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors + standardizálható spot szám és méret meghatározás)

40. Aspotok számaaz ellenanyag vagy citokin termelő sejtek számát mutatja Aspotok mérete arányos az ellenanyag vagy citokin termelő képességgel A spotok által elfoglalt összterület mindkét paramétert egyesíti, a számítógépes szoftver mindkettőt figyelembe veszi

41. Western blot Fehérjekeverékek egyes (pl. sejt lizátumok) komponenseinek ellenanyag segítségével történő specifikus kimutatására alkalmas. Azok tulajdonságai (pl. foszforilációs állapota) is vizsgálható vele. • Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei sok, legalább 106 sejt szükséges a vizsgálathoz

42. A fehérjék SDS-PAGE-enelektroforetikus mobilitásuk alapján „méret” szerint szétválaszthatók (dot-blot vagy slot-blot esetén nincs szétválasztás) A hozzávatőleges méretet ismert méretű standard fehérje keverék egyidejű futtatásával meghatározhatjuk. A kezelhetőség érdekében a szétválasztott fehérje sávokat membránra viszik át (PVDF, nirocellulóz) Specifikus ellenanyaggal mutatható ki a keresett fehérje sávja a többi sáv között, (vagy anti-foszfotirozin elleanyaggal a foszforilált fehérjék sávja)

43. Western Blot • Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik: • enzimmel konjugált ellenanyag • indirekt módszer (primer és szekunder ellenanyagok) Protein minta Standard Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján Western blot Membrán SDS-PAGE

44. pl. aktivált T sejtek foszfotirozin és Zap-70 blotja A membrán az anti P-Y ellenanyagok elúciója után anti ZAP-70 ellenanyagokkal is megjelölhető, így azonosítható a ZAP-70 foszforilációs állapota a sejtekben aktiválatlan ConA PHA Y P-Y P-Y P-Y blot

45. A pozitív HIV tesztet megerősítő WB vizsgálati módszerek: Western-blot: HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak.

46. Megnövelt kemilumineszcencia /Enhanced chemiluminescence (ECL)/ • H2O2jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidáljaa diacilhidrazidokat (pl luminol) • Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba • A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható • A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák • (pl 6-hidroxi-benzothiazol)jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer) Immobilizált proteinek Primerellenanyag Fab Fc Torma- peroxidáz luminol H2O2 h Epitóp a protein felszínén luminol enhancer Detektálás H2O Szekunderellenanyag Membrán

47. „Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok (1.) (proteomika?)

48. ( + ) IL-2 IL-4 … MIP3β … IFN … ( - ) Cytokine array Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas A Western-blot blotolási lépését követő részére hasonlít különféle kikötött specifikus ellenanyagok Jelzett ellenanyagok keveréke Vizsgálandó citokin tartalmú oldat Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

49. CD40L és CD40L+SLAM kombinációval aktivált moDC citokin termelése Réthi és mtsi. 2006

50. Immunhisztokémia / Immunfluoreszcencia • Szöveti vagy sejthez kötött komponenseket mutathatunk ki specifikus • AG- EA reakció alapján. (a fixált szövetmetszet szilárd fázisnak felel meg.) • Fixálás: A minta átjárható legyen és az Ag determinánsok ne károsodjanak paraformaldehid, glutáraldehid – kémiai keresztkötések • alkoholok – vízelvonó szer • (szövettípustól és az antigéntől függően) • Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a • szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban • Immunfluoreszcencia • fluoreszcensen jelzett ellenanyag • – fluoreszcens mikroszkóp • FITC – fluoreszcein izotiocianát • PE – fikoeritrin, stb. • Immunoenzim módszer • enzimmel konjugált ellenanyag • P – peroxidáz • PA – alkalikus foszfatáz • (a szubsztátból oldhatatlan, színes • csapadékot képeznek) Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása