实验九
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 23

实验九 PCR 扩增检测转基因大豆、玉米 PowerPoint PPT Presentation


  • 123 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

实验九 PCR 扩增检测转基因大豆、玉米. 【 实验目的 】 通过 PCR 扩增方法检测市场常见大豆、玉米产品是否含有转基因成分 培养学生的实验设计能力和创新能力. 【 实验原理 】. 以大豆特异性内源基因大豆凝集素 (Lectin) 基因或者玉米特异性内源基因 IVR 为内参, 花椰菜花叶病毒 35S 启动子 (CaMV35S 启动子 ) 、农杆菌胭脂碱合成酶终止子 (NOS 终止子 ) 及外源基因 5- 烯醇丙酮 - 莽草酸 -3- 磷酸合酶 (CP4-EPSPS) 基因为靶基因检测大豆和玉米中的转基因成分。.

Download Presentation

实验九 PCR 扩增检测转基因大豆、玉米

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Pcr

实验九 PCR扩增检测转基因大豆、玉米

【实验目的】

  • 通过PCR扩增方法检测市场常见大豆、玉米产品是否含有转基因成分

  • 培养学生的实验设计能力和创新能力


Pcr

【实验原理】

以大豆特异性内源基因大豆凝集素(Lectin)基因或者玉米特异性内源基因IVR为内参, 花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动子)、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)及外源基因5-烯醇丙酮-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4-EPSPS)基因为靶基因检测大豆和玉米中的转基因成分。


Dna ctab

【实验步骤】大豆、玉米DNA 提取--改良的CTAB法

  • 称取0.1g样品,在研钵中充分研磨。加入1000μL CTAB提取液,继续研磨充分后加入到1.5mL Ep管中;向EP管加入4μL RNaseA,至于65℃水浴,过程中混匀3~5次,30min,12000r/min室温离心10min;取上清于新的Ep管中,加入等体积氯仿:异戊醇(24: 1),轻缓颠倒数次(或至于漩涡震荡器上混匀),室温静置5min,室温12000r/min离心10min;重复加入氯仿异戊醇一到两次 (过程中如上清液量太少,可适量加入三重蒸馏水);取上清于新的Ep管(千万不要吸入下层液体),再加入等体积的CTAB沉淀液,轻缓颠倒混匀后室温静置1h,15000 r/min室温离心10min;弃上清液,加入400μL 1.2mol/L氯化钠溶解沉淀,56℃温浴15min,期间轻摇EP管数次助溶;加入800μL -20℃无水乙醇,-20℃静置1h,15000 r/min室温离心10min;弃上清液,用75%乙醇洗涤沉淀两三次后,在室温下自然风干用三重蒸馏水溶解储存于4℃。


Pcr

【实验步骤】基因组DNA浓度和纯度的鉴定

  • 取5μL样品溶于95μL三重蒸馏水中,用 Biophotometer分析DNA的浓度,通过它对提取大豆DNA测OD值。并记录数据。由OD260nm/OD280nm判定基因组DNA的浓度,其比值在1.7~2.0之间较好,符合PCR检测要求。


Pcr

  • 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法,其基本原理类似于DNA的天然复制过程。 它包括: 变性(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25~35轮循环就可使DNA扩增达106倍。


Pcr

主要试剂

Taq DNA polymerase 底物:10mMdNTP

引物对:1μmol/L PCR缓冲液 ddH2O


Pcr

主要实验器材


Pcr

PCR主要操作步骤

标记试管

加入各种试剂、混匀、离心(最后加酶)

设立PCR循环程序,进行扩增


Pcr

标记PCR反应管


Pcr

加入试剂


Pcr

【实验步骤】

  • 1. 在0.2 mL Eppendorff管内调制50 μL反应体系:


Pcr

反应管放入PCR仪


Pcr

编辑程序进行扩增


Pcr

PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸。


Pcr

2. 按下述程序进行PCR扩增:

  • 1) 94℃ 预变性 3 min;

  • 2) 94℃ 变性 1 min;

  • 3) 54℃ ( 或者56℃ )退火 45 sec;

  • 4) 72℃ 延伸 1 min;

  • 5) 重复步骤2~4, 29次;

  • 6) 72℃ 延伸 10 min;

  • 7) End.


Pcr

3. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果

  • 配制0.8%琼脂糖凝胶,取PCR产物5μL加1μL点样液混合后点入上样孔,于120V电压电泳20~30min。电泳结束后,用自动凝胶成像分析系统检测


Pcr

M 1 2 3 4 5 6 7

M 1 2 3 4 5 6 7

外源基因( EPSPS)特异性扩增

内源基因(Lectin)特异性扩增

1 2 3 4 5 6 7 M

M 1 2 3 4 5 6 7

1

2

外源启动子(CaMV35S)特异性扩增

外源终止子(NOS) 特异性扩增

1 未加模板对照 2 转基因大豆、玉米 3~7 非转基因大豆、玉米


Pcr

PCR假阳性结果

1. 引物设计不当,应调换引物

2. 循环参数不合适,导致非特异性扩增

3. 靶序列的交叉污染

PCR假阴性结果

1. 模板问题

2. 试剂浓度不够

3. 标本中有Taq酶的抑制剂

4. PCR产物检测系统灵敏度不够


Pcr

【注意事项】

1 提取高质量的模板DNA是PCR成功的决定因素之一

2 注意防止试剂的交叉污染


Pcr

五 结果处理

分析PCR产物电泳结果,判断所测样品是否含转基因成分。


Pcr

【思考题】

  • 1、影响PCR反应效率的因素有哪些?

  • 2、为什么检测转基因大豆或者玉米时,以大豆凝集素(Lectin)基因、玉米特异性内源基因IVR为内参 ?


  • Login