Az rns interferencia szerepe a g nregul ci ban
Download
1 / 25

Az RNS interferencia szerepe a génregulációban - PowerPoint PPT Presentation


  • 75 Views
  • Uploaded on

Az RNS interferencia szerepe a génregulációban. Az RNS interferencia felfedezése : az RNS interferencia jelensége, felfedezése miRNS : a miRNS-ek felfedezése, keletkezése, szerepe az RNS interferenciában 3. miRNS célpontok keresése állatokban. 1. Az RNS interferencia felfedezése.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Az RNS interferencia szerepe a génregulációban' - yaholo


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  • Az RNS interferencia felfedezése: az RNS interferencia jelensége, felfedezése

  • miRNS: a miRNS-ek felfedezése, keletkezése, szerepe az RNS interferenciában

    3. miRNS célpontok kereséseállatokban


1 az rns interferencia felfedez se
1. Az RNS interferencia felfedezése

  • 2006: orvosi Nobel-díj

    Craig C. Mello,

    Andrew Fire

  • Kísérletek: C. elegans-on (fonálféreg)

    1. az elcsendesíteni kívánt gén mRNS-ével egyszer azonos, másszor ellentétes szekvenciájú RNS bejuttatása → génelcsendesítés mindegyik esetben

    ha egyszerre juttatták be → erősebb génelcsendesítés

    2. az állatokat genetikailag módosított baktériumokkal etették (az állat egyik génjének mRNS-ével azonos felépítésű duplaszálú mRNS-eket termelt) → úgy viselkedtek, mint akiknek nincs adott működőképes génjük

    (Nature: 1998-ban publikálták)


2 a mikrorns ek felfedez se keletkez se szerepe az rns interferenci ban
2. A mikroRNS-ek felfedezése, keletkezése, szerepe az RNS interferenciában

Transzkripciós faktorok, miRNS-ek és azok születése

sokfajta génszabályozás

-transzkripciós faktorok: • fehérjék, gátolják vagy aktiválják a transzkripciót

• kis cisz-regulációs elemekhez kötődnek

-mikroRNS:

érett mikroRNS:

•rövid, nemkódoló ssRNS-ek (egyszálú RNS), amelyek gátolják a mRNS-ek transzlációját

• kötődik a mRNS vele komplementer szakaszához (miRNS kötőhely)

≈70 nukleotidból álló hajtű struktúrából vágódik ki (pre-miRNS)

a Dicer enzim vágja ki


pre-miRNS: interferenciában

a pri-miRNS-ből (primery miRNS) vágja ki a Drosha enzim

pri-miRNS:

a DNS-ből az RNS-polimeráz II. által átírt elsődleges miRNS átirat

több száz nukleotid hosszúságú is lehet, több pre-miRNS-t tartalmazhat néha a fehérjekódoló gének intronjaiban vannak (a splicinggal vágódnak ki)

Növényeknél a miRNS érés a sejtmagban történik.


Humán genom interferenciában: 328 miRNS-t azonosítottak eddig

nagyobb, mint 1%-a a géneknek miRNS-t kódol

a fehérjekódoló gének több, mint 30%-áról hiszik azt, hogy miRNS-ek regulálják

Arabidopsis: 199 miRNS


A mirns ek felfedez se
A miRNS-ek felfedezése interferenciában

  • ~22 nukleotid hosszú RNS-ek

  • A mRNS-hez kötődnek, génelcsendesítés:

    → hasítás

    → transzlációs represszió

    1993: Victor Ambros, Rosalind Lee, Rhonda Feinbaum

  • Felfedezik, hogy a lin-4 C. elegans-ban található gén, ami a lárvafejlődés időzítéséért felelős nem fehérjét, hanem egy pár rövid RNS-t kódol

  • Az egyik RNS ~22 nukleotid hosszú, a másik ~61 nukleotid hosszú

  • A lin-4 RNS-eknek „antisense” (a mRNS átirat szálával komplementer) komplementaritásuk van több helyhez a lin-14-es gén 3’ UTR szakaszában

    → csökken a LIN-14 fehérje mennyisége anélkül, hogy a lin-14 mRNS mennyisége csökkenne

     modell: a lin-4 RNS a lin-14 3’ UTR-jének egy szakaszával párt alkot,

    transzlációs repressziót végez

    (egy regulációs útvonal része, ami az első lárva állapotból a második lárva állapotba való átmenetet indítja el)


  • 2001 interferenciában: a rövidebbik lin-4 RNS a kicsi reguláló RNS-ek csoportjába tartozó RNS: miRNS

  • 2003: miRNS funkciók eddig:

    • sejtosztódás

    • sejthalál

    • zsír metabolizmus a legyekben

    • neurális mintázatok kialakulása a nematodákban

    • levél- és virágfejlődés a növényeknél


A., interferenciábanC.Elegans stem loop-ok a lin-4, let-7 esetébenB., Példák állatokban található stem loop-okra (a mir-1, mir-34, mir-124 esetén) C., Három Arabidopsis stem loop (MIR165a, MIR172a2, JAW)

piros: értett miRNS-ek

kék: kísérleti úton megtalált szekvenciák


N v nyi llati mirns
Növényi, állati miRNS interferenciában

  • A növényekben a stem loop-okban lévő visszahajlások méret szempontjából sokkal változatosabbak, mint az állatokban

  • Növényekbennagyobb a komplementaritása miRNS és a stem loop másik karja között, mint az állatokban

  • Növényekben keskenyebb méreteloszlás van a miRNS 21 nukleotidja körül, mint az állatoknál, itt 22-23 nukleotid körül van az eloszlás


Regul ci rns interferenci val
Reguláció RNS interferenciával interferenciában

RISC komplex

- Miután létrejönnek a miRNS-ek (növényekben, állatokban, gombákban), siRNS-ek (állatokban), csak az egyik szál kerül bele egy ribonukleoprotein komplexbe ( RNA including scilencing complex): RISC

• Az elcsendesítendő mRNS-t olyan üzenetek alapján ismeri fel, ami a tökéletes, vagy majdnem tökéletes bázispárosodáson alapul

- A RISC-en található endonukleáz hasítja a mRNS-t közel a komplementer szakasz közepéhez

A RISC-et légy és emberi sejtekből izolálták

- A miRNS-eket először a miRNP komplexben találták meg (miRNA ribonukleoprotein komplex)

• ugyanazokkal a speciális tulajdonságokkal rendelkezik, mint a RISC, lehet, hogy a RISC egy altípusa

- Amikor a miRNS:miRNS* duplexből a miRNS bekerül a RISC komplexbe, akkor a miRNS* degradálódik

• A duplexnek az a szála kerül be a komplexbe, amelyiknek az 5’ végénél lazább a bázispárosodás


Mrns has t s transzl ci represszi
mRNS hasítás, transzláció represszió interferenciában

Hasítás

  • Ha a mRNS és a miRNSkomplementaritása megfelelő, akkor hasítás

    Transzlációs represszió

  • Ha nincs megfelelő komplementaritás ahhoz, hogy hasítson → elnyomja a transzlációt

    Jelenség:

    A lin-4 RNS-ek expressziójával korreláltan csökken a LIN-14 fehérje mennyisége, eközben a mRNS-ek száma nem változik

    A lin-14 mRNS poliszóma profiljaaz első lárvaállapotban megkülönböztethetetlen a későbbi lárvaállapotokétól, amelyekben már a LIN-14 fehérje mennyisége csökkent


Két lehetséges magyarázat: interferenciában

  • lin-4 RNS a transzlációs iniciáció után elnyomja a transzlációt úgy, hogy nem változtatja meg a riboszómák sűrűségét az üzeneten

    (pl. riboszómák lassítása vagy megállítása)

  • A transzláció ugyanúgy folytatódik tovább, de az új szintetizálódó polipeptid specifikusan degradálódik

    Néhány megjegyzés:

    - Jelentős komplementaritás kell a hasításhoz

  • Az állatoknál kisebb mértékű a komplementaritás, mint a növények esetében → az állatoknál jelentősebb a transzlációs represszió, mint a növényeknél

    - Több RISC komplex hatására történik hatásos transzláció inhibíció, ezért is jó, ha több miRNS komplementer hely van a mRNS-en (állatoknál)

    - Néhány miRNS a DNS transzkripciós csendesítését is végezheti


A., mRNS hasítás interferenciában

B., transzlációs represszió

C., transzkripciós génelcsendesítés


3 mirns c lpontok keres se llatokban
3. miRNS célpontok keresése állatokban interferenciában

Korai szakasz:

- (2003) egy légy miRNS (bantam) negatívan regulálja a pro-apoptotikus hid gént

hid gén → híd fehérje: elősegíti az apoptózist

(gátolja az apoptózist gátló faktort (IAP), így teszi lehetővé, hogy bekövetkezzen az apoptózis)

- a Drosophila, gerincesek esetében sok más miRNScélpont-jóslás a következők alapján:

1. kevés kísérletileg azonosított valószínűsíthető célponthoz való kapcsolódási hely

(20 kapcsolódási hely 2 miRNS-re Drosophilában)

2. Megfigyelés: az ismert poszttranszkripciós regulációs motívumok a 3’ UTR- ben teljes mértékben komplementerei néhány légy miRNS 5’ végének

3. in vitro kísérletek eredménye: több kapcsolódási hely a 3’ UTR-ben exponenciálisan megnöveli a mRNS elcsendesítésének mértékét

Ezek az eljárások nem csak a komplementaritás alapján értékelték a miRNS-mRNS párokat, hanem a kapcsolódáskor érvényes szabadenergiára is. (scoring)


  • kiderült: interferenciában6-8 bp hosszú szakaszok, amelyeknél tökéletes Watson-Crick bázispárok alakulnak ki a miRNS-mRNS között → ezek segítettek a legtöbbet a szabályozott mRNS-ek megtalálásában

    • általában a miRNS 5’ végén helyezkednek el (seed site)

    A 6-8 bp hosszú tökéletes W-C bázispárokból álló szakaszokat nukleusznak szokták nevezni

  • A létrejött nukleusz, (legyőzve a hőmozgást) a két szál gyors összecipzározódását segíti elő

    majd a mRNS-miRNS duplexben bázispárok kialakulásával termodinamikailag stabilizálódik a rendszer

    - Az algoritmusok kapcsán felmerülő szempontok, nehézségek

    • Állati miRNS-ek esetén a kapcsolódási hely kicsi, ezért korlátozott a komplementaritása → ha kis eltérés van az algoritmusban, nagy eltérés lehet a célpontmeghatározásban

    • általában az algoritmusok az evolúciós szempontból konzervált kapcsolódási helyeket tekintik biológiailag fontosnak célpont-meghatározás szempontjából


interferenciábankülönböznek az eljárások a következőkben:

a kapcsolódási helyek konzerváltságának mértékét máshogy határozzák meg

(scoring szabályai)

az ortológ 3’ UTR szekvenciát hogyan definiálják, hogyan vizsgálják

• probléma:

hogyan vegyék figyelembe a 3’ UTR szekvencia hosszát → rövidebb 3’ UTR- ben lévő kapcsolódási hely hatékonyabban vagy kevésbé hatékonyan csndesíti a mRNS-t

(hogyan számítsuk bele a score-ba)


Célpont-meghatározás ma: interferenciában

  • Kapcsolódási hely mutációs kísérleteken és az azt követő bioinformatikai analízisen alapul (gyakran felhasználják a fajok összehasonlításából kapott eredményeket)

    a mutációs kísérletek megmutták: kétfajta célpont létezik

    1. Tökéletes W-C bázispárok kialakulása a miRNS 5’ végének ‘seed’ szakaszához

    2. Nem tökéletes illeszkedés az 5’ végen lévő szakaszhoz, további bázispárok alakulnak ki a miRNS 3’ végénél

  • Az első csoportba tartozó kapcsolódási helyek száma egy nagyságrenddel nagyobb, mint a második csoportba tartozók száma


a., Az első csoporthoz tartozó interferenciában

és a

b., a második csoporthoz tartozó

miRNS-ek kapcsolódása a mRNS-hez


Az algoritmusok összehasonlítása: interferenciában

  • ~ 130 kísérletileg meghatározott mRNS-miRNS (Drosophila) alapján értékelték az algoritmusokat

    (Cohen Laboratory, EMBL)

  • A legjobban szereplő két algoritmus:

    PicTar, EMBL:

    90%-os pontosság (annak a valószínűsége, hogy az algoritmus konzisztens a kísérlettel)

    70-80% érzékenység

    (mennyire képes az algoritmus tényleges mRNS-miRNS párokat találni)

    A többi algoritmus nem ért el ilyen érzékenységet és pontosságot, de sok más célpontot is megtalált


mRNS-miRNS párok: (példák) interferenciában

miRanda

miRBase

PicTar

TargetScan, TargetScanS

RNA hybrid

mRNS-miRNS párokat kereső eszközök:

RNAhybrid

DIANA-MicroT

RNA22

mRNS-miRNS párok

kísérletileg alátámasztott adatbázisa:

Tarbase

Argonaute

miRNAMAP


##txt Format

##source-version miRanda 3.0

##created on:2007-10-31

##GROUP SEQ METHOD FEATURE CHR START END STRAND PHASE SCORE PVALUE_OG TRANSCRIPT_ID EXTERNAL_NAME

Similarity cel-miR-785 miRanda miRNA_target III 1772526 1772547 - . 18.9884 2.999100e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4

Similarity cel-miR-796 miRanda miRNA_target III 1772391 1772413 - . 18.2142 3.818450e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4

Similarity cel-miR-236 miRanda miRNA_target III 1772565 1772588 - . 17.4222 2.849710e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4

Similarity cel-miR-236 miRanda miRNA_target III 1772565 1772588 - . 17.4222 2.849710e-02 Y39A3CL.4a Y39A3CL.4

Similarity cel-miR-260 miRanda miRNA_target III 1765303 1765322 - . 17.2423 2.781390e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4

Similarity cel-miR-262 miRanda miRNA_target III 1765264 1765283 - . 17.932 4.266260e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4

Similarity cel-miR-36 miRanda miRNA_target III 1765281 1765302 - . 16.3733 2.782390e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4

Similarity cel-miR-37 miRanda miRNA_target III 1765281 1765302 - . 15.691 4.356940e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4

Similarity cel-miR-787 miRanda miRNA_target III 1759917 1759941 + . 17.0828 3.145560e-02 Y46E12A.2 Y46E12A.2

Similarity cel-miR-72 miRanda miRNA_target III 1751881 1751903 - . 17.9879 2.637880e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3

Similarity cel-miR-60 miRanda miRNA_target III 1751955 1751977 - . 17.6485 2.983430e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3

Similarity cel-miR-73 miRanda miRNA_target III 1751881 1751903 - . 19.2323 9.934760e-03 Y46E12A.3 Y46E12A.3

Similarity cel-miR-74 miRanda miRNA_target III 1751881 1751902 - . 17.2829 4.588090e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3

Similarity cel-miR-266 miRanda miRNA_target III 1751881 1751900 - . 17.1274 4.344880e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3

Similarity cel-miR-51 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 15.8384 3.247690e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4

Similarity cel-miR-52 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.008910e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4

Similarity cel-miR-53 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.294690e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4

Similarity cel-miR-54 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.321450e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4

Similarity cel-miR-271 miRanda miRNA_target III 1723215 1723235 - . 16.3227 2.590130e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4

Similarity cel-miR-55 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 16.4041 2.930900e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4

Similarity cel-miR-56 miRanda miRNA_target III 1723248 1723268 - . 16.1459 3.430470e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4

Similarity cel-miR-273 miRanda miRNA_target III 1723248 1723266 - . 16.2078 2.475660e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4

Similarity cel-miR-38 miRanda miRNA_target III 1723215 1723239 - . 16.1459 4.123270e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4

Similarity cel-miR-51 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 15.8384 3.247690e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4

Similarity cel-miR-52 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.008910e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4

Similarity cel-miR-53 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.294690e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4

Similarity cel-miR-54 miRanda miRNA_target III 1723248 1723271 - . 15.7625 4.321450e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4

Similarity cel-miR-271 miRanda miRNA_target III 1723215 1723235 - . 16.3227 2.590130e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4

Similarity cel-miR-55 miRanda miRNA_target III 1723248 1723270 - . 16.4041 2.930900e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4

Similarity cel-miR-56 miRanda miRNA_target III 1723248 1723268 - . 16.1459 3.430470e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4

Similarity cel-miR-273 miRanda miRNA_target III 1723248 1723266 - . 16.2078 2.475660e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4

Similarity cel-miR-38 miRanda miRNA_target III 1723215 1723239 - . 16.1459 4.123270e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4

Similarity cel-miR-239b miRanda miRNA_target III 1716235 1716258 - . 16.6007 4.554820e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12

Similarity cel-miR-269 miRanda miRNA_target III 1716473 1716492 - . 16.3227 4.615520e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12

Similarity cel-miR-73 miRanda miRNA_target III 1716472 1716494 - . 17.9879 2.771030e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12

Similarity cel-miR-74 miRanda miRNA_target III 1716472 1716494 - . 17.5103 3.831370e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12

C. elegans miRNA-ek és célpontok


Irodalom:

Cell

David P. Bartel: MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function

Nature Genetics

Nikolaus Rajewsky: microRNA target predictions in animals


ad