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实验三 细菌的培养技术

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实验三 细菌的培养技术. 实验目的要求. 1. 掌握基础培养基的制备及消毒灭菌技术; 2. 掌握细菌培养的接种方法,进一步熟悉无菌操作技术; 3. 掌握细菌的一般培养法;并学会细菌生长现象的观察。. 实验内容. 一、培养基的制备. 1 、培养基的概念: 是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。 2 、培养基的营养物质: 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类、水。 3 、培养基的其它成分: 凝固剂、抑制剂、指示剂。. (一)基本知识. 4 、培养基的种类和用途. ( 1 )按用途分类:.

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实验目的要求
  • 1.掌握基础培养基的制备及消毒灭菌技术;
  • 2.掌握细菌培养的接种方法,进一步熟悉无菌操作技术;
  • 3. 掌握细菌的一般培养法;并学会细菌生长现象的观察。
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实验内容

一、培养基的制备
  • 1、培养基的概念:是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。
  • 2、培养基的营养物质:蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类、水。
  • 3、培养基的其它成分:凝固剂、抑制剂、指示剂。

(一)基本知识

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4、培养基的种类和用途

(1)按用途分类:

  • 基础培养基:培养营养要求不高的细菌,如普通平板;
  • 营养培养基:能满足营养需求较高细菌的生长,如血平板;
  • 鉴别培养基:含有某些特定的底物,用于鉴别细菌,如克氏双糖培养基(KIA);
  • 选择培养基:具有选择性抑制作用,用于选择性的培养目的菌,如SS平板;
  • 增菌培养基:促进目的菌的生长,适用于含菌量较少的标本,如葡萄糖肉汤;
  • 厌氧培养基:用于培养厌氧菌。
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(2)按物理性状分类:
  • 液体培养基:不含凝固剂,用于增菌和接种纯种细菌。
  • 半固体培养基:含0.3%~0.5%琼脂,用于观察细菌的动力。
  • 固体培养基:含2%~2.5%琼脂,多用于细菌的分离培养。
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(二)实验器材
  • 常用玻璃器材:培养皿、试管、烧杯、三角烧瓶、玻棒等。
  • 培养基的成分:普通琼脂培养基、蛋白胨、牛肉浸膏、NaCl、琼脂粉等。
  • 称量工具:普通天平、电子天平。
  • 灭菌器材:高压蒸汽灭菌锅、干烤箱等。
  • 培养基的制作:无菌室、超净工作台。
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干烤箱

用途:

适用于玻璃器皿、油剂、粉剂等的灭菌;

温度160~170℃,时间2h。

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(三)实验方法

1.常用玻璃器材的准备:清洗、灭菌2.培养基制备的一般程序1.常用玻璃器材的准备:清洗、灭菌2.培养基制备的一般程序

称量

培养基灭菌方法

溶化

★ 基础培养基:121.3℃高压蒸汽灭菌15分钟

分装

★ 含糖培养基:113 ℃灭菌15分钟

灭菌

★ 鸡蛋、血清培养基:间歇灭菌3天3次

倒平板

保存

★ 不耐高温的液体成分:滤过除菌

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(1)液体培养基的制作
  • 成分:

牛肉浸膏(0.2g)

蛋白胨(0.5g)

氯化钠(0.25g)

50mldH2O等。

  • 程序:

称量;熔化;分装(试管);灭菌;保存

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2.半固体培养基:在肉汤中加入0.2%~0.5%的琼脂即成。50ml肉汤中0.2g琼脂粉。2.半固体培养基:在肉汤中加入0.2%~0.5%的琼脂即成。50ml肉汤中0.2g琼脂粉。

程序:称量;熔化;分装(试管);灭菌;保存

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3.固体培养基:在肉汤中加入2%~3%的琼脂即成;或直接用营养琼脂粉配置。3.固体培养基:在肉汤中加入2%~3%的琼脂即成;或直接用营养琼脂粉配置。

平板制作程序:称量3.5g琼脂粉配100ml固体培养基。

称量;熔化;分装(三角烧瓶);灭菌;倒平板;保存

试管斜面制作程序:

称量;熔化;分装(试管);灭菌;斜置;保存

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二、细菌接种法

(一)实验器材
  • 菌种:金黄色葡萄球菌培养物、白色葡萄球菌培养物、大肠杆菌培养物、枯草杆菌培养物、变形杆菌培养物;
  • 培养基:普通琼脂平板、试管斜面、液体培养基、半固体培养基;
  • 实验器材:接种环、接种针、酒精灯、记号笔、试管架等。
  • 以上菌种每人一种,以上培养基每人一套
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细菌接种的要求

无菌操作

  • 细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。
  • 无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。
  • 细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌
  • 标本的采集
  • 无菌试管、烧瓶的使用
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接种工具
  • 常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。

图-6

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(二)接种方法

细菌接种的基本程序

灭菌接种环

杀灭接种环沾染的细菌,以免污染标本

沾取标本

接种

灭菌接种环

杀灭接种环沾染的细菌,以免污染环境

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1.细菌的琼脂平板分离划线接种法
  • 菌种:葡萄球菌、大肠埃希菌等普通琼脂培养物;
  • 培养基:固体平板培养基;
  • 用途 :该法主要是借助划线而将混杂的细菌在琼脂表面分散开,使单个细菌能固定在某一点,生长繁殖后形成单个菌落,以达到分离纯种的目的。
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细菌的分离—平板划线法
  • 1.分区划线法:
  • 2.连续划线法:
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(1)分区划线法

第一区划线

灭菌接种环

第二区划线

灭菌接种环

第三区划线

灭菌接种环

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2. 细菌的纯种接种法

当细菌分离成纯种后,常需要接种到相关的培养基中,以测试其各种生物学性状。一般可用斜面、半固体、液体培养基来检验细菌的培养特性,相应培养基的接种方法有三种。

  • 琼脂斜面接种法
  • 液体接种法
  • 半固体接种法
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(1)琼脂斜面接种法
  • 菌种:葡萄球菌、大肠埃希菌等普通琼脂培养物;
  • 培养基:斜面固体培养基;
  • 用途:扩增细菌、保存菌种;或用于观察其某些生化特性。
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(2)液体接种法
  • 菌种:葡萄球菌或大肠埃希菌、枯草杆菌等普通琼脂培养物;
  • 培养基:液体培养基;
  • 接种方法:液体接种法。
  • 从斜面菌种接入液体培养液;从液体培养液接入液体培养液;
  • 用途:扩增细菌,用于观察细菌的生长特性或测定其生化特性。
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(3)半固体穿种接种法
  • 菌种:葡萄球菌、大肠埃希菌等普通琼脂培养物;
  • 培养基:半固体培养基
  • 接种方法:穿刺接种法。用接种针垂直地穿入培养基中心至底部;然后沿着原接种线将针拔出。
  • 用途:检验细菌的运动性或观察细菌的生化反应。
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三、细菌培养法

(一)实验器材:恒温培养箱

(二)实验方法

  • 一般培养(需氧培养):
    • ★培养温度: 35~37℃
    • ★培养时间:18~24h

将已接种好细菌的培养基置于35~37℃的恒温培养箱中,经18~24h培养后,观察细菌生长现象。

  • 二氧化碳培养法:烛缸法、二氧化碳培养箱
  • 厌氧培养法:厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等
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细菌在固体培养基中的生长现象
  • 菌落:
    • 定义:指单个细菌在平板培养基上37℃18-24h的生长繁殖,形成单一的肉眼可见的细菌集团。
    • 菌落特征:大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性
    • 菌落类型:光滑型(S)、粗糙型(R)、黏液型(M)
  • 菌苔:指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。
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菌落(R型)

菌落(S型)

菌苔

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细菌在液体培养基中的生长现象
  • 混浊:大多数细菌
  • 沉淀:多见于链状排列的细菌
  • 菌膜:多见于需氧菌
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细菌在半固体培养基中的生长现象
  • 有鞭毛细菌:在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长,穿刺线边缘模糊。
  • 无鞭毛细菌:只沿穿刺线生长,穿刺线边缘清晰。
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