实验三 细菌的培养技术 - PowerPoint PPT Presentation

• 1.掌握基础培养基的制备及消毒灭菌技术；

• 2.掌握细菌培养的接种方法，进一步熟悉无菌操作技术；

• 3. 掌握细菌的一般培养法；并学会细菌生长现象的观察。

实验内容

• 1、培养基的概念：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。

• 2、培养基的营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类、水。

• 3、培养基的其它成分：凝固剂、抑制剂、指示剂。

（一）基本知识

（1）按用途分类：

• 基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板；

• 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板；

• 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（KIA）；

• 选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如SS平板；

• 增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤；

• 厌氧培养基：用于培养厌氧菌。

• 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。

• 半固体培养基：含0.3％～0.5％琼脂，用于观察细菌的动力。

• 固体培养基：含2％～2.5％琼脂，多用于细菌的分离培养。

• 常用玻璃器材：培养皿、试管、烧杯、三角烧瓶、玻棒等。

• 培养基的成分：普通琼脂培养基、蛋白胨、牛肉浸膏、NaCl、琼脂粉等。

• 称量工具：普通天平、电子天平。

• 灭菌器材：高压蒸汽灭菌锅、干烤箱等。

• 培养基的制作：无菌室、超净工作台。

干烤箱

用途：

适用于玻璃器皿、油剂、粉剂等的灭菌；

温度160~170℃，时间2h。

高压蒸汽灭菌器

超净工作台

（三）实验方法

称量

培养基灭菌方法

溶化

★ 基础培养基：121.3℃高压蒸汽灭菌15分钟

分装

★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟

灭菌

★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次

倒平板

保存

★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌

• 成分:

  牛肉浸膏（0.2g）

  蛋白胨（0.5g）

  氯化钠（0.25g）

  50mldH2O等。

• 程序：

  称量;熔化;分装(试管);灭菌;保存

2.半固体培养基：在肉汤中加入0.2%～0.5%的琼脂即成。50ml肉汤中0.2g琼脂粉。

程序：称量；熔化；分装(试管)；灭菌；保存

3.固体培养基：在肉汤中加入2%～3%的琼脂即成；或直接用营养琼脂粉配置。

平板制作程序：称量3.5g琼脂粉配100ml固体培养基。

称量；熔化；分装(三角烧瓶)；灭菌；倒平板；保存

试管斜面制作程序：

称量；熔化；分装(试管)；灭菌；斜置；保存

二、细菌接种法

• 菌种：金黄色葡萄球菌培养物、白色葡萄球菌培养物、大肠杆菌培养物、枯草杆菌培养物、变形杆菌培养物；

• 培养基：普通琼脂平板、试管斜面、液体培养基、半固体培养基；

• 实验器材：接种环、接种针、酒精灯、记号笔、试管架等。

• 以上菌种每人一种，以上培养基每人一套

无菌操作

• 细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。

• 无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。

• 细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌

• 标本的采集

• 无菌试管、烧瓶的使用

• 常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。

图－6

（二）接种方法

灭菌接种环

杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本

沾取标本

接种

灭菌接种环

杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境

• 菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌等普通琼脂培养物；

• 培养基：固体平板培养基；

• 用途 ：该法主要是借助划线而将混杂的细菌在琼脂表面分散开，使单个细菌能固定在某一点，生长繁殖后形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。

• 1.分区划线法：

• 2.连续划线法：

第一区划线

灭菌接种环

第二区划线

灭菌接种环

第三区划线

灭菌接种环

当细菌分离成纯种后，常需要接种到相关的培养基中，以测试其各种生物学性状。一般可用斜面、半固体、液体培养基来检验细菌的培养特性，相应培养基的接种方法有三种。

• 琼脂斜面接种法

• 液体接种法

• 半固体接种法

• 菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌等普通琼脂培养物；

• 培养基：斜面固体培养基；

• 用途：扩增细菌、保存菌种；或用于观察其某些生化特性。

琼脂斜面培养基接种法

• 菌种：葡萄球菌或大肠埃希菌、枯草杆菌等普通琼脂培养物；

• 培养基：液体培养基；

• 接种方法：液体接种法。

• 从斜面菌种接入液体培养液；从液体培养液接入液体培养液；

• 用途：扩增细菌，用于观察细菌的生长特性或测定其生化特性。

• 菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌等普通琼脂培养物；

• 培养基：半固体培养基

• 接种方法：穿刺接种法。用接种针垂直地穿入培养基中心至底部；然后沿着原接种线将针拔出。

• 用途：检验细菌的运动性或观察细菌的生化反应。

（一）实验器材：恒温培养箱

（二）实验方法

• 一般培养（需氧培养）：
  • ★培养温度： 35~37℃

  • ★培养时间：18～24h

    将已接种好细菌的培养基置于35~37℃的恒温培养箱中，经18~24h培养后，观察细菌生长现象。

• 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱

• 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等

• 菌落：
  • 定义：指单个细菌在平板培养基上37℃18-24h的生长繁殖，形成单一的肉眼可见的细菌集团。

  • 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性

  • 菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）

• 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。

菌落（R型）

菌落（S型）

菌苔

菌落的形态特征有助于细菌的鉴别

• 混浊：大多数细菌

• 沉淀：多见于链状排列的细菌

• 菌膜：多见于需氧菌

• 有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。

• 无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。