基因的转录和转录后加工
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基因的转录和转录后加工. 内容. 第一节 转录概述. 第二节 合成 RNA 的酶类. 第三节 原核生物基因的转录. 第四节 真核基因的调控区. 第五节 真核基因的转录因子. 第六节 真核基因转录的起始和终止. 第七节 真核基因转录产物的加工. 第一节 转录概述. 基因的表达. 看家基因. Housekeeping gene. A. B. C. A5 A1 Shanchuanzi B9 Yubaibei. IbF3'H. G14. 基因在五个不同层次上的 调控.

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基因的转录和转录后加工

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Presentation Transcript


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基因的转录和转录后加工


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内容

第一节 转录概述

第二节 合成RNA的酶类

第三节 原核生物基因的转录

第四节 真核基因的调控区

第五节 真核基因的转录因子

第六节 真核基因转录的起始和终止

第七节 真核基因转录产物的加工


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第一节 转录概述

基因的表达

看家基因


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Housekeeping gene


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A

B

C

A5 A1 Shanchuanzi B9 Yubaibei

IbF3'H

G14


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基因在五个不同层次上的调控

转录前调控

转录调控

转录后调控

翻译调控

翻译后调控


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一、基因的编码链和有意义链

ATGCATGCAT 编码链,有义链

TACGTACGTA 模板链、反义链

AUGCAUGCAU


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二、转录的四个阶段

  • 识别启动子

  • 起始

  • 延伸

  • 终止


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第二节 合成RNA的酶类

一、原核生物RNA pol

二、真核生物RNA pol


Rna pol

一、原核生物RNA pol

  • RNA pol 负责所有mRNA,rRNA和tRNA的合成

  • 一个E.coli细胞RNA pol总数约7000个

  • RNA pol全酶由5个亚基组成,即α2ββ'σ,分子量465KD, α2ββ'构成核心酶。


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全酶的组成


Rna pol1

RNA pol的基本性质


Rna pol2

二、真核生物RNA pol

3种RNA pol:

  • RNA pol I

  • RNA pol II

  • RNA pol III


Rna pol3

真核RNA pol的性质


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第三节 原核生物基因的转录

一、原核基因启动子的结构

二、原核基因转录的起始

三、RNA的延伸

四、原核基因转录的终止


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一、原核基因启动子的结构

  • 转录的第一步就是RNA pol结合到DNA分子上,发生结合的特殊位置叫启动子(promotor)

  • 在特定启动子上是否启动决定了该基因是否表达的关键步骤

  • 分析上百种启动子序列,发现不同启动子都存在保守的共同序列,含有RNA pol识别和结合的位点


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上 游 与 下 游

下 游 区 域

上 游 区 域

启 动 子

基 因


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原核生物启动子


1 pribnow box 10

1、Pribnow box(-10序列)

  • 共同序列:TATAAT

  • -4~-13bp之间

  • 决定转录的方向,是RNA pol的牢固结合位点,称为结合位点


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-10序列对转录的效率影响

  • TATAAT→AATAAT,转录效率下降,称为下降突变(down mutation)。

  • TATGTT→TATATT,转录效率上升,为上升突变(up mutation)。

  • 以上突变为何会影响转录效率?

  • 前者可能由于T-A的堆集能要小于A-T的堆积能,后者可能是由于堆集能降低和氢键的减少,


2 sexfama box 35

2、Sexfama box(-35序列)

  • 共同序列:TTGACA

  • TTG十分保守T82T84G78A65C54A45

  • RNA pol全酶依靠σ因子的起始识别位点,也称识别位点


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典型启动子的结构

-35 -10 转录起点

TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp


E coli

E.coli的启动子


3 cap

3、CAP位点

  • CAP位点是cAMP受体蛋白(cAMP-CAP)的结合部位。

  • E.coli有两个CAP位点,位点I位于-70— -50,位点II位于-50— -40。


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CAP位点

RNA pol

I

II

σ因子

-60

-45

-35

-10


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  • 当葡萄糖减少时,腺苷酸环化酶(ACase)使ATP转变为cAMP,cAMP与其效应蛋白CAP结合成复合物cAMP-CAP。

  • 一定浓度的复合物cAMP-CAP首先结合于位点I,从而提高位点II结合cAMP-CAP 的能力。

  • 一旦位点II被cAMP-CAP占据,RNA pol就很快识别接触-35序列,然后再与-10序列结合


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二、原核基因转录的起始

1、σ因子的作用

2、RNA pol与启动子的结合

3、封闭型复合物转变为开放型复合物

4、形成三元起始复合物

5、σ因子的解离


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1、σ因子的作用

  • 识别启动子


2 rna pol

2、RNA pol与启动子的结合

  • σ因子发现识别位点,全酶与-35序列接触,形成一个封闭型启动子复合物。

  • 全酶分子很大,一端与-35位点接触,另一端可以达到-10序列,形成封闭型启动子复合物。


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Sigma 因子的识别模式

核心酶

聚 合 酶

DNA一条链

基 因

启动子区域


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3、封闭型复合物转变为开放型复合物

  • RNA pol全酶分子向-10序列方向转移,并与之牢固结合,然后在-10序列及起始位点处发生局部解链,即开放型启动子复合物。

  • -10序列的共同序列主要是AT碱基对,需要较低的解链能量,有利于DNA融化为开放性的单链。


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开放型复合物的形成


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4、形成三元起始复合物

  • DNA开链形成17bp的开链区是正确引入核苷酸底物的必要条件,这时第一个底物NTP进入起始位点。

  • RNA合成的起始刚刚开始,就形成三元复合物,DNA-RNA pol-RNA。


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起始复合物的形成


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5、σ因子的解离

  • 三元复合物的形成表示转录起始阶段的结束,σ因子从全酶上解离下来。


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三、RNA的延伸

  • 一旦进入延伸阶段,酶与产物RNA不解离,底物NTP不断地加到RNA链的3'-OH端,RNA链不断延伸,并保持三元复合物的结构

  • 有17bp DNA形成解链区,产物RNA链有12bp与模板形成RNA-DNA杂合双链。


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信 息 的 合 成

DNA模板链

RNA聚合酶

RNA 链 的 序 列

合 成 方 向


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四、原核基因转录的终止

  • RNA pol沿模板移动,直到遇到终止子(Terminator,t)

  • 终止子是终止转录的信号序列

  • 转录的终止依赖于RNA产物,而不是由特定的DNA 序列决定的。


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1、终止子的种类

  • 强终止子——内部终止子

  • 弱终止子——ρ依赖性终止子


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2、终止子的结构特征

  • 强终止子的反向重复序列中富含GC

  • 强终止子的反向重复序列的下游常有6-8个AT碱基对,且模板链上为AAAA·······AAA


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终止子上的倒置重复序列

重 复

倒 置


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茎 环 结 构

环:

(未配对碱基)

茎:

(倒置重复之

间碱基配对)


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2、终止子的结构特征

  • 弱终止子的反向重复序列中GC含量较低

  • 弱终止子的反向重复序列的下游无固定特征


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3、终止子的作用机制

  • 强终止子的作用机制

  • 弱终止子的作用机制


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强终止子的作用机制

  • 反向重复序列转录的RNA易形成发夹结构(hairpin)或茎环结构(stem and loop),且3‘端为寡聚U

  • 发夹结构使RNA pol暂停。

  • 寡聚U使RNA-DNA杂合链的3'端部分出现不稳定的rU•dA区域,末端区域rU•dA的双链解开

  • 真正的终止点不是固定在某一碱基,而是在寡聚U几个碱基中的任何一处,或者在寡聚U的末端发生。


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强终止子终止转录

A与U结合较弱,转录酶与转录结构分开,从而转录结束


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弱终止子的作用机制

  • ρ因子:55KD的蛋白质,六聚体

  • 活性:终止转录活性和NTPase活性

  • NTPase水解NTP释放能量,使因子结合在RNA产物新生的5‘端,并从5’向3‘移动;

  • 在转录终止时,NTPase水解RNA从三元复合物中释放出来


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弱终止子的转录终止


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第四节 真核基因转录的启动子

一、类型I基因的启动子

二、类型II基因的启动子

三、类型III基因的启动子


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真核启动子含有不同的组件

SV40 早期启动子

胸苷激酶

组蛋白H2B

-140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 +1

  • Oct CAAT GC TATA


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一、类型I基因的启动子

  • RNA pol I转录生成18S、5.8S、28S rRNA

  • 不同真核生物的rDNA转录起始位点邻近的序列是完全不同的,因此,RNA pol I启动子区域有较大的差异

  • rRNA基因具有显著的种属特异性

  • 不同种属的rDNA调控区具有某些共同的特征


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rRNA基因重复单位

  • 拷贝区

  • 外间区(ETS)

  • 内间区(ITS)

  • 非转录区(NTS)


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非转录区(NTS)的基本组分

  • 启动子

  • 增强子

  • 终止子


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核心序列(核心启动子)

  • 人的rDNA的核心序列在-45—+20

  • 小鼠的rDNA的核心序列在-45—+9

  • 缺失、替代、突变都会消除或强烈降低rDNA转录能力

  • 决定转录起始的精确位置


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上游控制元件(UCE)

  • -150— -107

  • 缺失、置换、插入等破坏这一区段序列,可造成rDNA转录下降100倍


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-170-160-150-140-130-120-110………-60--50-40-30-20- 10 1 +10+20

上游控制区核心启动子

UBF1 UBF1结合于G-C 丰富区

SL1 SL1与UBF1协同结合

TFⅡB

Pol 1

?


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二、类型II基因的启动子

(一)转录起始位点

(二)基本启动子

(三)上游元件(UPE)

(四)远端调控区


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真核生物类型II基因的调控区


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(一)转录起始点

帽子位点(Cap site)

  • 是转录的起始位点(INR)


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(二)基本启动子

TATA box(Hogness box)

  • TATAAAA,两侧富含GC

  • 位于-26—-34,-30左右

  • 决定转录起始的选择。


Tata box

TATA box

  • 有的真核基因中没有TATA box,如腺病毒DNA结合蛋白基因(27kd)

  • TATA box的缺失使转录不能选择特定的起始位点,因而形成几种不同的5端的mRNA。如海胆H2A基因

  • TATA box突变会使转录频率大大下降


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TATA突变


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(三)上游启动子(UPE)

1、CAAT box

  • GGC/TCAATCT

  • 位于-75,-70—-80

  • 开头两个G的重要性等于CAAT部分,非常保守

  • 可能是真核生物RNA pol II的结合部位,决定转录起始的频率


Caat box

CAAT box

  • 缺失、突变会导致转录活性大大下降

  • 兔β-珠蛋白启动子CAAT缺失、GGCCAATCT变成TTCCAATCT,则转录活性只剩12%

  • CCAAT变为TCAAT,则转录活性只剩下25%


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(三)上游启动子(UPE)

2、 GC box

  • GGGCGG

  • 位于-80—-110

  • GC区与sp1等转录因子结合,可提高转录起始的频率


Enhancor

(四)远端调控区—增强子(Enhancor)

  • 能增强基因的转录

  • 1981年,Beneji发现SV40 DNA的一个140bp序列能增加β-血红蛋白的表达,这是人们发现的第一个增强子。

  • 增强子含有两个正向重复的序列,每个长72bp。

  • 目前在病毒、动物、植物和人类细胞里都发现了增强子。


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启动子分类

  • 组成型启动子

  • 诱导型启动子

  • 组织特异性启动子


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三、类型III基因的启动子

(一)基因内启动子

(二)基因外启动子

(三)混合型启动子


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(一)基因内启动子

  • 编码tRNA、5SrRNA、Alu的大多数基因

  • 5SrRNA基因内的启动子位于+55—+80,两端有A box和C box。

  • tRNA基因内启动子位于+8—+72之间,其中A box位于+8—+30,B box位于+51—+72

  • 在真核生物内A、B、C box是相对保守的

  • 基因内启动子决定转录的起始与否,而转录起始频率主要由转录起始点决定


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1 型内部启动子 2 型内部启动子

转录起始点 转录起始点

boxA boxC boxA boxB

TFIIIA TFIII C TFIII C

TFIII B TBP τA τB

TFIII C TFIII B

Plo III Pol III


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(二) 基因外启动子

  • snRNA、U6和人的7SK RNA

  • 位于被转录序列的上游

  • 三种启动子元件:

    1、TATA结构

    2、近端序列元件(PSE):-60bp

    3、远端序列元件(DSE):-250bp(增强子)


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(三)混合型启动子

  • 海胆硒代半胱氨酸tRNA(ser)sec基因

  • 酵母U6基因


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启动子克隆方法

  • 反向PCR

TAIL-PCR

Termal Asymmetric Interlaced PCR


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启动子功能


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  • CaMV 35S 启动子是一个组成型启动子,不仅可以能在双子叶植物中高效启动基因表达,而且在许多单子叶植物中也可以高效启动基因表达。

叶片横切面

幼苗

35S 启动子控制的GUS基因在烟草中表达


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拟南芥ACTIN2基因启动子分析


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启动子必需元件的确定


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第五节 真核基因的转录因子及转录过程

  • 原核生物RNA pol不需要其他蛋白质因子参与就能起始转录反应,而真核生物RNA pol需要一定的蛋白质才能起动转录反应。

  • 真核基因转录所必需的蛋白质因子统称为转录因子(transcription factor ,TF)

  • 顺式作用元件

  • 反式作用因子


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转录因子 的 作 用

转录因子先结

合,然后帮助

RNA聚合酶结合

将要转录

的基因

RNA聚合酶


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TF的类型

1、通用的转录因子(普遍性转录因子)

  • 结合于启动子核心序列

  • TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIIA、TFIIIB、TFIIIC

    2、基因特异性转录因子

  • 结合于上游调控区UPE和增强子区

  • SP1、CTF、Ap-1、Ap-2、Oct-2、CREB


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广泛研究的TF

  • 识别TATA区的TFIID

  • 识别CAAT区的CTF

  • 识别GC区的SP1


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转录因子

一、RNA pol II的转录因子

二、RNA pol I的转录因子

三、RNA pol III的转录因子


Rna pol ii

一、RNA pol II的转录因子及转录过程

  • 普遍性转录因子

  • 调控因子


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普遍性转录因子


Rna pol ii1

RNA pol II的普遍性转录因子


Tfiid

TFIID

  • TFIID结合于TATA box

  • TFIID由多种亚基组成,其中一种亚基称为TBP(TATA结合蛋白,TATA binding protein),是参与各种RNA pol起始复合物装配的必要组分。

  • TFIID的其余亚基称为TBP相关因子(TBP-associated factor,TAF)

  • 定位因子TBP(相当于σ因子)


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  • SL1(pol I);

  • TFIID(pol II);

  • TFIIIB(pol III)


Rna pol ii2

RNA pol II的调控因子


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TBP Pol III 启 动 子

TFIIIB TFIIIC

TBP RNA Pol III

Pol I 启 动 子

SL1 RNA Pol I

TBP UBF1 Pol II 启 动 子

TFIID TATA 转录起始点

RNA Pol II


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类型II启动子形成前起始复合物的过程

模板TATA

D、A

B

TATA-D-B

TATA-D

pol

RNA

B-pol-E

TATA-D-B-pol

E

NTPs

TATA-DB-pol-E

TATA-D-B-pol-E

ADP

ATP


Rna pol i

二、RNA pol I的转录因子及转录起始

  • 3种转录因子:UBF、SL1、TF1C


Rna pol iii

三、RNA pol III的转录因子及转录起始

  • TFIIIA、TFIIIB、TFIIIC、TFIIID、UBF等


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真核的转录起始是通过蛋白与DNA间以及蛋白与蛋白间的相互作用形成复杂的起始转录复合物而实现转录起始。


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锌指(zinc finger)结构域

螺旋-转角-螺旋结构域

亮氨酸拉链(leucine zipper,LZIP)


Zinc finger

锌指(zinc finger)结构域

  • C2H2

  • C4

  • C6


Hth helix turn helix hth

螺旋-转角-螺旋结构域 HTH(helix-turn-helix,HTH)


Leucine zipper lzip

亮氨酸拉链(leucine zipper,LZIP)

亮氨酸拉链二聚体另一端肽段富含碱性氨基酸残基(Lys、Arg),借其正电荷与DNA链上的磷酸基团结合


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酵母杂交技术

  • 酵母单杂交:DNA-Pr

  • 酵母双杂交:Pr -Pr


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第六节 真核基因转录产物的加工


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真核基因转录产物的加工

一、原核生物和真核生物基因转录的差异

二、5`帽子结构

三、3`端polyA化

四、真核基因转录产物的剪接结构

五、RNA的3种剪接方式

六、RNA的编辑


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一、原核生物和真核生物基因转录的差异

1、RNA pol的差异

  • 原核生物只有一种RNA pol负责所有类型的RNA。

  • 真核生物有3种RNA pol(I、II、III),负责不同类型基因的转录,合成不同类型的RNA。

  • Pol I(18S、5.8S、28S);pol II(mRNA);pol III(tRNA和5SrRNA)


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2、转录产物的差别

  • 原核生物的初始产物与蛋白质序列成线性关系

  • 真核生物的初始产物包含内含子序列,因此转录产物要经过剪切、连接等过程除去内含子


3 5 3 polya

3、转录产物的加工真核生物转录产物要经过修饰作用,即5'端帽化和3'端polyA化


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成熟的真核mRNA

帽子

外显子

尾巴

起始密码子

5‘端

加尾信号

3‘端

5‘非翻译区

3‘非翻译区

帽子

…或者…

尾巴


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细 菌 的 多 顺 反 子 mRNA

4、与基因结构相吻合,原核生物mRNA是多顺反子,而真核生物mRNA是单顺反子


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5、时空差异

  • 真核生物成熟的mRNA转移到细胞质内参与蛋白质的生物合成,转录与翻译相对独立

  • 原核生物的转录和翻译在细胞的同一部位进行


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2、mRNA的加工

转录

加尾信号

剪接加工

帽子

Poly-A尾巴

翻译


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5'帽子结构

  • 7-甲基鸟苷(m7G)通过5'-5'三磷酸二酯键与mRNA上的第一个核苷酸相连。

  • RNA鸟苷酸甲基转移酶,加帽酶或戴帽酶

  • 形成m7G5ppp5Np结构


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加 帽 过 程

加帽酶


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帽子的种类

  • Cap0(0类帽子): m7G5ppp5Np

  • CapI(1类帽子): m7G5ppp5NmpNp

  • CapII(2类帽子):m7G5ppp5NmpNmpNp


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5'端帽子的功能

1、对翻译起识别作用

  • 5'端接有m7Gppp的mRNA优先与核糖体结合

  • 除去m7G的珠蛋白mRNA不能翻译。

  • 不是所有的真核生物都有5帽子结构

    2、保护mRNA免遭5外切核酸酶的降解

  • 有帽子的比无帽的更加稳定

  • 帽子结构上的G如果不带甲基,翻译效率差,但稳定性不变


3 polya

3`端polyA化

  • 绝大多数真核生物mRNA 3`端有polyA尾巴,长度为20—200bp。

  • polyA聚合酶,RNA 末端腺苷酸转移酶

  • ATP为前体

  • polyA尾巴并不是加到转录终止的3`末端,而是由RNAase III切除一段后,再由polyA聚合酶催化加上polyA尾巴


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加尾信号

  • RNAase III的识别位点为酶切位点上游的AAUAAA和下游的GUGUGUG

  • 特异内切酶——识别加尾位点并切割下游10至30bp处

  • 多聚腺苷聚合酶加上100至200个A


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加上Poly - A 尾巴

RNA聚合酶

加尾信号

核酸酶

我只认AAUAAA信号!

RNA切下

Poly-A聚合酶

加Poly-A

我只负责加A!


Polya

polyA尾巴的功能

1、polyA是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式

2、polyA可大大提高mRNA在细胞质中的稳定性

  • polyA短的mRNA半衰期短,polyA长的mRNA半衰期长


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  • 大部分真核mRNA具有polyA尾巴,细胞中仍有多达1/3无polyA的mRNA。

  • polyA+

  • polyA-


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三、rRNA的加工

  • 分子内切割

  • 化学修饰—甲基化


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16S 23S

clusters

some tRNA 5s

rRNA 的剪接与成熟

E.coli 5s (120Nt), 16s (1541Nt), 23s (2904Nt)

in some cluster with tRNA


Rna splicing

RNA Splicing


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四、tRNA的转录后加工

1、切除tRNA前体两端多余序列(RNaseP)

2、末端的添加:3`端加CCA

3、修饰碱基:甲基化修饰占50%

4、蛋白质剪接内含子


Rna editing

五、RNA的编辑(editing)

  • mRNA前体的加工,除了加帽、加尾、剪接、修饰等程序外,某些mRNA前体的核苷酸序列需加以改编,方能变成为有活性的正确的翻译模板。

  • 改编过程包括在mRNA前体分子中插入、剔除或置换一些核苷酸残基。


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RNA的编辑的例子

  • 布氏锥虫和簇生型短膜虫线粒体cytc氧化酶亚基II(COII)基因的转录产物5`端附近有4个非基因编码的U

  • 布氏锥虫cytb蛋白mRNA5`端含有34个非基因编码的U

  • 锥虫COIII的mRNA中约有60%序列是由RNA编辑加上去的额外U

  • 在绒泡菌线粒体mRNA前体中有C的插入

  • 在麻疹病毒mRNA前体中有G的插入


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相继在真核生物及病毒中发现

---U inserted & deleted in mRNA

---C transition into U in mammal

---多头绒泡菌线粒体中 C, A, U的插入

---小麦线粒体 ND3 mRNA中CU,GA;GU;A I

--- some genes edited with high frequency

锥虫 mt coxIII mRNA 407 U inserted in 145 loci

19 U deleted in 9 loci

绒泡菌mRNA of ATP synthertaseαsubunit

54 site C inserted


Rna grna

指导RNA(gRNA)


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RNA 编 辑

转录产物

咔嚓!

剪除多余的U

终产物mRNA


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Editing 的生物学意义

● 形成/删除AUG, UAA, UAG, UGA…

● 改变codon信息

● 扩大编码的遗传信息量

● 能增加基因产物的多样性

● 使基因产物获得新的结构和功能,有利于生物进化


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问题???

  • 遗传信息是否都存在于基因序列中?

  • 指导RNA编辑的遗传信息是什么?

  • RNA编辑的起源及其进化意义?

  • RNA编辑如何进行加工?

  • RNA编辑在mRNA生成的哪个阶段进行?

  • 为什么某些转录产物被编辑,而另外一些不编辑?


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本章结束


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