ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΜΕ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΔΙΕΙΣΔΥΣΗΣ ΣΕ ΖΩΝΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ

1. ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΜΕ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΔΙΕΙΣΔΥΣΗΣ ΣΕ ΖΩΝΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΕΥΣΕΒΕΙΑ ΦΡΑΚΟΛΑΚΗ Α.Μ.: 294106 ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Λ. Χ. Μαργαρίτης, Καθηγητής Τομέα Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τμήμα Βιολογίας Παν/μίου Αθηνών, (Επιβλέπων) Π. Λυμπέρη, Διευθύντρια Ερευνών, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, (Επιστ. Υπεύθυνος) Ρ. Τσιτσιλώνη, Επίκουρη Καθηγήτρια Τομέα Φυσιολογίας Ζώων και Ανθρώπου, Τμήμα Βιολογίας Παν/μίου Αθηνών ΤΟΠΟΣ ΔΙΕΞΑΓΩΓΗΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, Εργαστήριο Ανοσολογίας

2. Φυσικά Αυτοαντισώματα (NΑAbs) Ανευρίσκονται στον ορό υγιών ατόμων απουσία εξωτερικής αντιγονικής διέγερσηςκαι παράγονται κυρίως από τα Β-1 κύτταρα • Κύρια χαρακτηριστικά: • πολυδραστικότητα (polyreactivity) αναγνώριση ευρέως φάσματος αντιγόνων διαφορετικής δομής, ενδογενούς και εξωγενούς προέλευσης • κωδικοποίηση από γονίδια της βλαστικής σειράς, με λίγες ή καθόλου μεταλλάξεις • τρεις κύριες τάξεις ανοσοσφαιρινών (IgG, IgM και IgA)

3. Ρόλος των Φυσικών Αυτοαντισωμάτων • Απομάκρυνση παραπροϊόντων του μεταβολισμού και αποπτωτικών κυττάρων (P. Grabar, 1983) • Συμμετοχή στην πρώτη γραμμή άμυνας έναντι παθογόνων παραγόντων • Ανοσορρύθμιση: • Θεωρία «ιδιοτυπικού-αντιιδιοτυπικού δικτύου» • Ρύθμιση κυτταροκινών (αναστολή, μεταφορά ή ενεργοποίηση) • Αναστολή πολλαπλασιασμού Τ- και B-κυττάρων • Άλλοι ρόλοι (π.χ. ενζυμική δράση)

4. Διεισδυτικά Αντισώματα (Ι) Φυσικά αντισώματα με ικανότητα διείσδυσης σε ζώντα κύτταρα (κυτταρόπλασμα ή και πυρήνα) • Χαρακτηριστικά: • έχουν μελετηθεί κυρίως σε ανθρώπους με SLE και σε ποντικούς με σύνδρομο Λύκου • αναγνωρίζουν κατά κύριο λόγο το DNA • διεισδύουν σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων • Δράση: • στον κυτταρικό κύκλο • στην απόπτωση • στη μεταγραφή γονιδίων

5. Διεισδυτικά Αντισώματα (ΙΙ) • Μηχανισμοί διείσδυσης μέσω : • Fab τμήματος, με περιοχές CDR2 & CDR3 πλούσιες σε θετικά φορτισμένα αμινοξέα • επιφανειακών κυτταρικών μορίων (ηπαρίνη, DNA, μυοσίνη 1, καλρετικουλίνη κ.α.) • κυστιδίων καλυμμένων με κλαθρίνη ή μικροκυστιδίων (caveoli) • Εφαρμογές: • Ως φορείς για την ενδοκυττάρια μεταφορά μορίων (πρωτεϊνών & γονιδίων)και άλλων σωματιδίων (ραδιενεργών μορίων κλπ)

6. Σκοπός της εργασίας Διερεύνηση της παρουσίας αυτοαντισωμάτων με ικανότητα διείσδυσης σε ζώντα κύτταρα σε υγιείς δότες Υλικό μελέτης: παρασκεύασμα IVIg

7. Ενδοφλέβια Ανοσοσφαιρίνη - IVIg Παράγωγο του αίματος που περιέχει ανθρώπινη πολυκλωνική IgG, απομονωμένη από το πλάσμα χιλιάδων υγιών δοτών (1.000 -100.000) • Χορηγείται στη θεραπείαανοσοανεπαρκειών,φλεγμονωδών και αυτοάνοσων διαταραχών • Διαθέτει δράση ανοσορρυθμιστική και υποκατάστασης • Φέρει ποικίλους μηχανισμούς δράσης • Έχουν μελετηθεί απομονωμένοι υποπληθυσμοί συγκεκριμένης ειδικότητας (π.χ. πληθυσμός αντι-FAS, αντι-DNP, αντι-ΙFN-α2α κλπ)

8. Absαντι-ιστονών Χρωματογραφία συγγένειας Absαντι-ηπαρίνης Απομονωμένοι Υποπληθυσμοί ΈμμεσοςΑνοσοφθορισμος ELISA Δοκιμασία διείσδυσης Στις κυτταρικές σειρές: • NIH-3T3 ινοβλάστες ποντικού • HeLa επιθήλιο ανθρώπου Έναντι: ιστόνων, ηπαρίνης, DNA, hTg, ΤNP, ακτίνης, τουμπουλίνης, F(ab’)2 και καρβονικής ανυδράσης • Κύτταρα 48 h • Επώαση με δείγμα 2 h • Μονιμοποίηση με αιθανόλη 100% ή παραφορμαλδεΰδη 2% (pfa) 20 min • Επώαση με αντι-hIgG συζευγμένο με Alexa 488 1h • Παρατήρηση στο συνεστιακό μικροσκόπιο Μεθοδολογία IVIg Intraglobin F

9. Απομονωμένοι Υποπληθυσμοί IVIg ΈμμεσοςΑνοσοφθορισμος ELISA Δοκιμασία διείσδυσης

10. Αντισωματική δράση της IVIg 400 μg/ml ΝΙΗ-3T3 HeLa ΝΙΗ-3T3 HeLa Μονιμοποίηση με pfa Μονιμοποίηση με αιθανόλη

11. Απομονωμένοι Υποπληθυσμοί IVIg ΈμμεσοςΑνοσοφθορισμος ELISA Δοκιμασία διείσδυσης

12. Διεισδυτική ικανότητα της IVIg 1,6mg/ml ΝΙΗ-3T3 HeLa Μονιμοποίηση με pfa 37οC HeLa ΝΙΗ-3T3 4 οC

13. Απομόνωση υποπληθυσμών της IVIg Απομόνωση Αbs αντι-Ιστόνες • ΙΣΤΟΝΕΣ Abs αντι-ιστόνες IVIg χωρίς Abs αντι-ιστόνες Ολική IVIg • ΗΠΑΡΙΝΗ Απομόνωση Αbs αντι-Ηπαρίνη Abs αντι-ηπαρίνη IVIg χωρίς Abs αντι-ηπαρίνη Ολική IVIg

14. Απομονωμένοι Υποπληθυσμοί IVIg ΈμμεσοςΑνοσοφθορισμος ELISA Δοκιμασία διείσδυσης

15. Αντισωματική δράση τωνυποπληθυσμών της IVIg 100 μg/ml Abs αντι-ιστoνών Αbs αντι-ηπαρίνης Μονιμοποίηση με αιθανόλη Abs αντι-ηπαρίνης Abs αντι-ιστονών ΝΙΗ-3T3 HeLa

16. Απομονωμένοι Υποπληθυσμοί IVIg ΈμμεσοςΑνοσοφθορισμος ELISA Δοκιμασία διείσδυσης

17. Abs αντι-ιστόνες Abs αντι-ηπαρίνη IVIg χωρίς Abs αντι-ιστόνες IVIg χωρίς Abs αντι-ηπαρίνη Ολική IVIg Ολική IVIg Abs αντι-ηπαρίνη IVIg χωρίς Abs αντι-ηπαρίνη Abs αντι-ιστόνες IVIg χωρίς Abs αντι-ιστόνες IVIg χωρίς Abs αντι-ιστόνες Abs αντι-ηπαρίνη IVIg χωρίς Abs αντι-ηπαρίνη Abs αντι-ιστόνες Ολική IVIg Ολική IVIg Abs αντι-ηπαρίνη IVIg χωρίς Abs αντι-ηπαρίνη Abs αντι-ιστόνες IVIg χωρίς Abs αντι-ιστόνες Ολική IVIg Abs αντι-ηπαρίνη IVIg χωρίς Abs αντι-ηπαρίνη Abs αντι-ιστόνες IVIg χωρίς Abs αντι-ιστόνες Ολική IVIg Abs αντι-ηπαρίνη IVIg χωρίς Abs αντι-ηπαρίνη Abs αντι-ιστόνες IVIg χωρίς Abs αντι-ιστόνες Ολική IVIg Abs αντι-ηπαρίνη IVIg χωρίς Abs αντι-ηπαρίνη Abs αντι-ιστόνες IVIg χωρίς Abs αντι-ιστόνες Ολική IVIg Abs αντι-ηπαρίνη IVIg χωρίς Abs αντι-ηπαρίνη Abs αντι-ιστόνες IVIg χωρίς Abs αντι- ιστόνες Ολική IVIg Abs αντι-ηπαρίνη IVIg χωρίς Abs αντι-ηπαρίνη Abs αντι-ιστόνες IVIg χωρίς Abs αντι-ιστόνες Αbs αντι-ιστόνες Ολική IVIg IVIg χωρίς Αbs Αντι-ιστόνες Πολυδραστικότητα των υποπληθυσμών της IVIg

18. Απομονωμένοι Υποπληθυσμοί IVIg ΈμμεσοςΑνοσοφθορισμος ELISA Δοκιμασία διείσδυσης

19. Διεισδυτική ικανότητα των υποπληθυσμών της IVIg (Ι) 200 μg/ml Abs αντι-ιστονών Abs αντι-ηπαρίνης Κύτταρα NIH-3T3 Μονιμοποίηση με αιθανόλη Abs αντι-ηπαρίνης Abs αντι-ιστονών 37οC 4 οC

20. Διεισδυτική ικανότητα των υποπληθυσμών της IVIg (ΙΙ) 200 μg/ml Abs αντι-ιστονών Abs αντι-ηπαρίνης Κύτταρα ΗeLa Μονιμοποίηση με αιθανόλη Abs αντι-ηπαρίνης Abs αντι-ιστονών 37οC 4 οC

21. Διεισδυτική ικανότητα της IVIg χωρίς τους υποπληθυσμούς σε συγκριση με την ολική 1,6 mg/ml Έκπλυση απoμόνωσης Absαντι-ιστονών Έκπλυση απoμόνωσης Absαντι-ηπαρίνης IVIg Κύτταρα NIH-3T3 Μονιμοποίηση με αιθανόλη

22. Συμπεράσματα (Ι) • Για πρώτη φορά βρέθηκαν aAbs με ικανότητα διείσδυσης που προέρχονται από υγιείς δότες – IVIg • Τα διεισδυτικά αυτά aAbs: • εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα και των δυο κυτταρικών σειρών, δίνοντας διαφορετική εικόνα • στικτή στην κυτταρική σειρά HeLa • ομοιογενής στην κυτταρική σειρά NIH-3T3 • αναγνωρίζουν και άλλα αντιγόναεκτός του DNA αλληλεπιδρούν μεταξύ τους (αναγνώριση του θραύσματος F(ab΄)2) • επηρεάζονται ως προς την διεισδυτική ικανότητά τους από τη θερμοκρασία και επομένως από τον κυτταρικό μεταβολισμό

23. Συμπεράσματα (ΙΙ) • Η διεισδυτική ικανότητα αυτών των aAbs προέρχεται σε μεγάλο βαθμό από συγκεκριμένους υποπληθυσμούς που αναγνωρίζουν τις ιστόνες και την ηπαρίνη • Και στις δυο κυτταρικές σειρές οι δύο υποπληθυσμοί: • παρουσιάζουν μεγαλύτερη ικανότητα διείσδυσης σε σχέση με την IVIg • διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τον εντοπισμό τους στο κυτταρόπλασμα • αντι -ιστόνες σε όλο το κυτταρόπλασμα • αντι -ηπαρίνης γύρω από τον πυρήνα

24. Ευχαριστίες • Λ.Χ. Μαργαρίτη,Καθηγητή Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστημίου Αθηνών • Π. Λυμπέρη,Ερευνήτρια Α΄ Εργαστηρίου Ανοσολογίας, Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ • Ο. Τσιτσιλώνη, Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστημίου Αθηνών • Αγγελική Σαλή, διδακτορική φοιτήτρια • Εργαστήριο Ανοσολογίας του Ε.Ι.Π.