实验六酶促反应中的竞争性抑制

实验六酶促反应中的竞争性抑制 《食品生物化学实验》课程

一、实验目的 1、掌握琥珀酸脱氢酶的提取方法 2、学习离心机和高速组织捣碎机的使用 3、观察竞争性抑制剂和底物浓度对酶促反应速率的影响二、实验原理琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢变为延胡索酸，脱下的氢转移到受氢体FAD。如果在有甲烯蓝存在的情况下，还原态的FADH2会迅速地把氢原子传递给甲烯蓝，从而引起非常明显的颜色变化反应，接受氢原子的甲烯蓝变为无色。酶的活性越高，甲烯蓝脱色的时间就越短。因此甲烯蓝脱色的快慢，可用来表示酶活性的高低。当结构上与琥珀酸极为相似的丙二酸存在时，琥珀酸脱氢酶活性受到抑制。由于还原的甲烯蓝容易被空气中的氧氧化而重现蓝色，所以本实验用石蜡油封闭反应液，制造无氧的环境。

三、实验步骤 1、琥珀酸脱氢酶的提取取新鲜猪心一个（100g），切碎，加100ml的1/15 mol•L-1 Na2HPO4，放入组织捣碎机中捣烂成浆。然后在高速离心机上用12000 rpm离心15min，0-4℃，取上清液即为琥珀酸脱氢酶提取液。（各组共用） 2、竞争性抑制观察取四支指形管，按下表依次加入各种液体（CK指形管中的酶液要事先煮沸10min），在指形管中加入酶液后，迅速加入甲烯蓝溶液并摇匀，立即加入石蜡油封闭液体（加入石蜡油封闭液体后千万不可震动），以隔绝空气。于室温下静止观察变色情况。

注：加入石蜡油封闭后开始计算时间，观察1、2、3号哪个退色最快，这个时间长一些，需要耐心等待、观察。2号最慢；1和3快。注：加入石蜡油封闭后开始计算时间，观察1、2、3号哪个退色最快，这个时间长一些，需要耐心等待、观察。2号最慢；1和3快。四、实验结果各指形管反应变色时间

五、讨论分析 1、对比1号管与2号管之间、2号管与3号管之间变色时间的差异，并做出合理的解释（底物、抑制剂、浓度等）。（1）1号管与2号管比较时间长短，解释原因。（2）2号管与3号管比较时间长短，解释原因。 2、封石蜡后为什么不能震荡? 六、改进实验建议

仪器和试剂 主要仪器：烧杯，滴管，指形管，离心机，组织捣碎机，恒温水浴锅。 • 1/15 mol•L-1 Na2HPO4（pH 7.4） • 1%琥珀酸，5%琥珀酸，1%丙二酸（琥珀酸、丙二酸用NaOH调正至pH7.4） • 0.02%甲烯蓝，石蜡油

实验六 酶促反应中的竞争性抑制