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第一章 基因与基因工程

第一章 基因与基因工程. 基因的现代概念. 重点知识点： 1 ，基本概念：移动基因，断裂基因，假基因，重复序列及重复基因，重叠基因； 2 ，三种转座模式； 3 ，基因产物的线性与非线性； 4 ，断裂基因的意义；. 了解： 1 ，卫星 DNA ， DNA 指纹的基本原理； 2 ，启动子、终止子、复制子； 3 ，内含子与外显子的特点； 4 ，重复序列的四种类型. 1 、移动基因. 转座因子，指染色体组上可以转移的基因。 实质：能够转移位置的 DNA 片断。

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第一章 基因与基因工程

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  1. 第一章 基因与基因工程

  2. 基因的现代概念 重点知识点： 1，基本概念：移动基因，断裂基因，假基因，重复序列及重复基因，重叠基因； 2，三种转座模式； 3，基因产物的线性与非线性； 4，断裂基因的意义； 了解： 1，卫星DNA， DNA指纹的基本原理； 2，启动子、终止子、复制子； 3，内含子与外显子的特点； 4，重复序列的四种类型

  3. 1、移动基因 转座因子，指染色体组上可以转移的基因。 实质：能够转移位置的DNA片断。 功能：在同一染色体内或不同染色体之间移动 引起插入突变、DNA结构变异（如重复、缺失、畸变） 通过表现型变异得到鉴别。 遗传工程：转座子标签法。 麦克林托克：玉米夫人 （1902-1992）

  4. （1）插入序列（IS elements，IS因子） 插入序列，具有一个控制转位作用的转位酶基因，通常被反向重复序列所包围 复合的转位子Tn1681,具有2个插入序列（ IS1 ）和一个热稳定大肠杆菌毒素1基因

  5. （2）转位子（Transposons,Tn） 由几个基因组成的特定的DNA片段，而且往往带有抗菌素的抗性基因，如氨苄青霉素转位子 按结构特征的不同，分为复合系和Tn3系 复合转位子：是由2个同样的IS因子连接在抗菌素抗性片段的两侧构成的，构成了“左臂”和“右臂”。两个“臂”可以是正向重复，也可以是反向重复。IS的末端序列任然保持反向重复特征 Tn3系：长度约5000bp，末端有一对38bp的IR序列，不含IS因子序列，带有3个基因，：一个编码对氨苄青霉素抗性的β-内酰氨酶基因，2个与转位有关的基因，TnpA基因(1015aa,转位酶)和TnpR基因（185aa，抑制TnpA基因的合成活性，促进在中间分解区发生位点特异的切割）

  6. TnpA TnpR β-Lac 中间分离区

  7. 1．复制转座(replicative transposition)转座因子在转座期间先复制一份拷贝，而后拷贝转座到新的位置，在原先的位置上仍然保留原来的转座因子。复制转座有转座酶(transposase)和解离酶(resolvase)的参与。转座酶作用于原来的转座因子的末端，解离酶则作用于复制的拷贝。TnA是复制转座的例子。 2．非复制转座(non-replicative transposition)转座因子直接从原来位置上转座插入新的位置，并留在插入位置上，这种转座只需转座酶的作用。非复制转座的结果是在原来的位置上丢失了转座因子，而在插入位置上增加了转座因子。这可造成表型的变化。 3. 保留转座(conservative transposition)也是非复制转座的一种类型。其特点是转座因子的切离和插人类似于入噬菌体的整合作用，所用的转座酶也是属于入整合酶(integrase)家族。出现这种转座的转座因子都比较大，而且转座的往往不只是转座因子自身，而是连同宿主的一部分DNA一起转座。 非复制转座可以是直接从供体分子的转座子两端产生双链断裂，使整个转座子释放出来，然后在受体分子上产生的交错接口处插入，这是“切割与黏接”(“cut and paste")的方式。另一种方式是在转座子分子同受体分子之间形成一种交换结构(crossover structure)，受体分子上产生交错的单链缺口，与酶切后产生的转座子单链游离末端连接，并在插入位点上产生正向重复序列；最 后，由此生成的交换结构经产生缺口(nick)而使转座子转座在受体分子。供体DNA分子上留下双链断裂，结果 或是供体分子被降解，或是被DNA修复系统识别而得到修复。

  8. （4）逆转位子 转座子可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子(retrotransposon)。 转位因子：通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段，重新插入基因组DNA中。根据转座的自主性，这类元件又可以分为自主转座元件和非自主转座元件。 自主转座元件能够编码转座酶而进行转座 非自主转座元件需在自主元件存在时方可转座，以玉米的Ac/Ds体系为例，Ac(Activator)属于自主元件，Ds(Dissociation)则是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能转座。 逆转位子(retroposon)，是由RNA介导转座的转座元件，在结构和复制上与反转录病毒(retrovirus)类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座，每转座1次拷贝数就会增加1份，因此它是目前所知高等植物中数量最大的一类可活动遗传成分。目前共发现了3种类型反转录转座子：Tyl-copia类，Ty3-gypsy类和LINE(long interspersed nuclear Clements)类转座子，前两类是具有长末端重复的转座子，LINE类转座子没有长末端重复。高等植物中的反转录转座子主要属于Tyl-copia类，分布十分广泛，几乎覆盖了所有高等植物种类

  9. 2、断裂基因（ split gene） 断裂基因：一个基因往往由几个互不相邻的段落组成，它们内部被长达数百个乃至上千个核苷酸对的间隔序列所隔开。 外显子：将DNA序列中被转录成为mRNA的片段称为外显子（exon或extron）。 内含子：而在成熟mRNA上未反应出的DNA区段称为内含子（intron）。

  10. 2.2.1 基因及其产物的共线性 基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。 2.2.2 基因及其产物的非共线性 由于真核生物的断裂基因具有内含子，使得一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列不是一一对应关系，则表明基因及其产物是非共线性的。 ATGGCGGCTGCCGGTGCTCTCTTTTTCCTATTCTCCTCCTTCTGC Met Ala Ala Ala Gly Ala Leu Phe Phe Leu Phe Ser Ser Phe Cys ATGGCGGCTGCCGGTGCTCTCTTTTTCCTATTCTCCTCCTTCTGC Met Ala Ala Ala Gly Ala…………………….…..Phe Ser Ser Phe Cys

  11. 2.4 内含子及外显子的一般特点 1，不同的断裂基因含有的间隔子数目有很大的差别 珠蛋白基因 2---胶原蛋白基因52 2，不同来源的间隔子的分子大小相差悬殊 SV40基因间隔子 31bp 人的营养不良蛋白基因间隔子210000bp 3，间隔子可有多种不同的位置，其长度还超过表达子 4，少数真核基因不存在间隔序列 如编码α-干扰素和β-干扰素的基因，及编码组蛋白的基因和多数酿酒酵母的基因 内含子是相对的，一个基因的内含子可能是另一个基因的外显子(如大鼠的肌钙蛋白基因）。

  12. 2.6 断裂基因的意义 ①有利于储存较多的信息，增加信息量：一般说，一个基因只转录出一种mRNA，但是一些断裂基因以不同的剪接方式可以产生两种以至多种mRNA，于是编码不同功能的多肽。 ②有利于变异和进化：虽然单个碱基的改变有时可以引起氨基酸的变更而造成蛋白质的变化，但是很难产生重大改变而形成新的蛋白质。更何况如这些单个碱基突变发生在密码子第三位上往往是沉默的，于是大大地降低了突变的效应。而在断裂基因中如果突变发生在内含子与外显子结合部位，那么就会造成剪接方式的改变，结果使蛋白质结构发生大幅度的变化，从而加速进化。 ③增加重组机率：内含子有可能不断地增减造成新的剪接方式，一方面形成新的基因，另一方面在剪接过程中无疑地会增加重组频率；同时在断裂基因中，由于内含子的存在，基因长度增加，于是也增加了重组频率。 ④可能是基因调控装置：内含子可能在基因表达中有一定的调控作用，在基因转录水平上以及在合成了mRNA以后的加工过程中起着调控基因表达的作用。

  13. 3、假基因（Pseudogenes） 假基因与有功能的基因在核苷酸顺序的组成上非常相似，却不具有正常功能的基因。是相应的正常基因在染色体的不同位置上的复制品，由于突变积累的结果而丧失活性。 1 重复的假基因 由含有亲本基因的染色体区段串联重复形成，故称为重复的假基因 符号ψ表示假基因 2 加工的假基因 其结构是同转录本而非亲本基因类似，没有启动子和间隔子，在基因的3’末端有一段延伸的腺嘌呤序列

  14. 4、重复序列及重复基因 几乎所有的真核细胞（酵母除外）的基因组DNA中都具有重复序列（repeated sequence）,它无转位移动能力，因此它区别于转位作用的IR（inverted repeat）。IR是指序列的重复性。但无基因序列的交叉重叠性，故不同于重叠基因序列。 重复序列可分为四种类型： (1)不重复序列，是唯一的序列，只有一个拷贝。 (2)低度重复序列，一般有1-10个拷贝。 (3)中度重复序列，有数十至数万（105）拷贝。 (4)高度重复序列 拷贝数可达106以上,包括卫星DNA、高丰度SINE家族的Alu序列 。

  15. （1）唯一或低度重复序列： 基因组中只有一个拷贝的序列。 在人类基因组中，单一序列绝大多数编码蛋白质或者酶的结构基因。 • 低度重复： 是指在基因组中含有2-10个拷贝的序列，如酵母tRNA基因、人和小鼠的珠蛋白基因等。 （2）中度重复序列 指在基因组中有10个以上直至几千个拷贝的长约300bp的序列，如rRNA和tRNA基因。 （3）高度重复序列 是指在基因组中拷贝数可多达十万次的一种简单的重复序列，有的重复单位长度不超过6bp。 卫星DNA(satellite DNA)：当将该DNA切成片段进行氯化铯密度梯度超速离心时，由于其富含A-T片段的浮力密度小，在离心管中常常单独形成一条较窄的带，在主体DNA带的上面，故称为卫星DNA。

  16. 小卫星（minisatellite）或可变串联重复序列（variable number tandem repeat，VNTRs）区： 这种特殊的串联重复在不同个体和基因组的不同位点上的数目都不同。已发现人类的VNTRs区为1-5kb大小的顺序。VNTR没有酶切位点，人总DNA限制性酶切后获得不同长度片段，以VNTR的特异序列为探针Southern杂交，阳性片段长度各不相同，不同个体具有高度的个体差异，成为DNA指纹。

  17. 两个或两个以上的基因共有一段DNA序列的现象。两个或两个以上的基因共有一段DNA序列的现象。 5 重叠基因(overlapping gene)：

  18. 第三节 基因工程的诞生及其主要的研究内容

  19. 一、基因工程的定义 在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。

  20. 二、基因工程诞生的理论基础 1 . DNA是遗传物质 （1）肺炎双球菌转化实验 1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。 （2）噬菌体转染实验 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。

  21. 2. DNA双螺旋结构 1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。

  22. 3. 中心法则和遗传密码 1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则” protein RNA DNA 1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码

  23. 三、基因工程诞生的技术突破 1. 限制性内切酶（restriction enzymes） 1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 Werner Arber 理论预见限制酶 Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶 1978年Nobel生理或医学奖

  24. 2. DNA连接酶（ligase） 1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。 3. 载体（vector） 1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。 4. 感受态体系 1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。

  25. 5. 琼脂糖凝胶电泳 1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。 6. DNA测序技术 1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术。 1980年Nobel化学奖

  26. 四、基因工程的诞生 1. Berg的开创性实验 1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验： 将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来。 （用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶） 1980年Nobel化学奖

  27. 2. Boyer-Cohen实验 1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。

  28. Boyer-Cohen实验

  29. Stanley Cohen 1986 Nobel生理或医学奖 Herb Boyer

  30. 3.2、基因工程的定义及其主要研究内容 在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖。 遗传工程 基因工程 基因操作 重组DNA技术 基因克隆 分子克隆 角度和侧重点的不同

  31. 3.2.1、基因工程的主要内容 1. 目的基因的获取 从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 2. 重组体的制备 将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。

  32. 3.重组体的转化 将重组体（载体）转入适当的受体细胞中，并与之一起繁殖。 4.克隆鉴定 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的受体细胞克隆（含有目的基因）。

  33. 5.扩增目的基因的获得 从筛选出的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。 6.目的基因表达 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的基因产物。

  34. 基因工程流程示意图

  35. 3.2.2 基因工程的特征 1. 跨物种性 外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。 2. 无性扩增 外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。

  36. 五基因工程的安全性 一、基因工程的安全隐患 1. 对环境的影响 重新组合一种在自然界尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。 2. 新型病毒的出现 制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。

  37. 3. 癌症扩散 将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。 4. 人造生物扩散 新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。

  38. 二、重组DNA研究的安全准则 1. 公众的担忧 1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。

  39. 2. 专家的态度 1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请Paul Berg博士组成一个重组DNA咨询委员会。 这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。

  40. 3.制定安全规则 1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。 规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。 1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。

  41. 4. 基因工程的安全措施 （1）实验室的物理安全 分4级：P1—P4级。 ① P1级实验室 一般装备良好的普通微生物实验室。 ② P2 级实验室 在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。

  42. ③ P3 级实验室 全负压的实验室，同时装备安全操作柜。 ④ P4级实验室 专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。 具有最高安全防护措施。

  43. （2）实验室的生物安全 分3 级（大肠杆菌）：EK1—EK3级。 ① EK1级的大肠杆菌 在自然环境中一般都要死亡。 ② EK2-EK3级大肠杆菌 在自然环境中无法存活。 第一个“安全”菌株是K12（1976年），很不实用，已淘汰。

  44. （3）载体的安全 应该是失去了自我迁移的能力。 不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。 （容易构建）。如pMB9，pBR322等。

  45. 六、基因工程的应用 6.1、基因工程在农业生产中的应用 1. 提高植物的光合作用效率 （1）提高CO2的固定率 改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。 （2）提高光能吸收率和转化率 改变光能交换系统的分子的基因结构。

  46. 2. 提高豆科植物的固氮效率 使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。 3. 转基因植物 是农业生物技术的主要内容。 是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。

  47. 转基因植物获得新的性状

  48. 无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻

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