第三章
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第三章. 核酸的结构与功能. 学习要求. 1 、 了解核酸的分类,掌握两类核酸的化学组成特点及核苷酸的结构。 2 、掌握 DNA 的一级结构连键方式; DNA 双螺旋结构模型要点; DNA 双螺旋结构模型提出对生命科学的重要意义。了解 DNA 双螺旋的一些特殊构型。 3 、了解 RNA 的种类,重点掌握与蛋白质合成有关的三种 RNA 结构特点、了解其生物学功能。 4 、掌握核酸的重要理化性质及相关概念与应用。. 概述 核酸的一级结构 DNA 的结构与功能 RNA 的结构与功能 核酸的理化性质及其应用 核酸酶和限制性核酸内切酶

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第三章

核酸的结构与功能


学习要求

1、了解核酸的分类,掌握两类核酸的化学组成特点及核苷酸的结构。

2、掌握DNA的一级结构连键方式;DNA双螺旋结构模型要点;DNA双螺旋结构模型提出对生命科学的重要意义。了解DNA双螺旋的一些特殊构型。

3、了解RNA的种类,重点掌握与蛋白质合成有关的三种RNA结构特点、了解其生物学功能。

4、掌握核酸的重要理化性质及相关概念与应用。


概述

核酸的一级结构

DNA的结构与功能

RNA的结构与功能

核酸的理化性质及其应用

核酸酶和限制性核酸内切酶

DNA一级结构测定与DNA的化学合成

基因和基因组


  • 1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素”

  • 1944年Avery等人证实DNA是遗传物质

  • 1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构

  • 1958年 Crick提出遗传信息传递的中心法则

  • 1968年 Nirenberg发现遗传密码

  • 1970年 建立DNA重组技术

  • 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶

  • 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法

  • 1985年 Mullis发明PCR 技术

  • 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)

  • 1994年 中国人类基因组计划启动

  • 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架

核酸化学的发展成就


第一节、概述

一.核酸的概念和重要性

DNA是主要遗传物质

存在细胞核(95%)和线粒体、叶绿体(5%)中

RNA的功能多样性

存在胞质(90%)和细胞核(10%)中


核酸的概念

  • 核酸是酸性的大分子物质,在活细胞中与碱性蛋白结合,以核蛋白形式存在。

  • 核酸分为脱氧核糖核酸 ( DNA )以及核糖核酸 (RNA)两类,DNA所含核苷酸分子数比RNA大得多。

  • DNA为线性双螺旋分子或闭合环状分子。

  • RNA分为三个类型,即核蛋白体 RNA(rRNA,占总RNA80%)、信使RNA(mRNA,占总RNA5%)和转移RNA(tRNA,占总RNA15%)。



核酸的重要性

  • DNA是遗传的物质基础,负责遗传信息的贮存和发布,遗传基因就是DNA链上的若干核苷酸所组成的片段。

  • RNA负责遗传信息的表达,直接参与蛋白质生物合成,转录DNA所发布的遗传信息,并将之翻译给蛋白质,使生命机体的生长、发育、繁殖和遗传得以继续进行。


核酸类物质RNA的重要功能


.核酸的化学组成及其基本结构单位核苷酸


  • 元素组成:C、H、O、N、P

  • P元素的含量较多并且恒定,约占9~11%。可利用这一特点通过定磷法测定核酸含量。

  • 碱基(嘌呤或嘧啶),戊糖(核糖或脱氧核糖) 和磷酸是核酸(DNA、RNA )的基本构件分子。核苷酸是核酸的基本组成单位。


(一)碱基(嘧啶和嘌呤)


常见的嘌呤和嘧啶

腺嘌呤

鸟嘌呤

胞嘧啶

尿嘧啶

胸腺嘧啶


存在于RNA中

存在于DNA中

(二)戊糖

组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D-2-脱氧核糖;RNA所含的糖则为β-D-核糖。


5’

5’

4’

1’

4’

1’

3’

2’

3’

2’

(OH)

(OH)

(三)核苷(nucleoside)

  • 核苷 戊糖+碱基

  • 糖与碱基之间的C-N键,称为C-N糖苷键

嘧啶核苷

嘌呤核苷




Nucleotide

H

H

H

H

H

H

H

H

H

(四)核苷酸(nucleotide)核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸

AMP

dAMP




AMP

ADP

ATP

(五)核苷酸衍生物

  • 1. 多磷酸化


2.环化磷酸化

cAMP

cGMP


3. 肌苷酸及鸟苷酸(特鲜味精)

IMP GMP

4. 辅酶

NAD、NADP、FMN等


5’

3’

5’

3’

第二节、核酸的一级结构

一、核酸中核苷酸的连接方式

  • 核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来,以磷酸-糖-磷酸-糖…形成核酸骨架


5′端

3′端


T

U

OH

OH

OH

OH

OH

OH

3’

5’

3’

5’

核酸的表示方式

若不特别注明,一般规定从5′端书写至 3′端

DNA RNA

5′PdAPdCPdGPdTOH 3′ 5′PAPCPGPUOH ′

或5′ACGTGCGT 3′ 5′ACGUAUGU 3′

ACGTGCGT ACGUAUGU


二、DNA和RNA的一级结构

  • 核酸的一级结构是核酸中各核苷酸通过3′,5′磷酸二酯键连接而成的无分支的多核苷酸链。即核苷酸排列顺序。

DNA为脱氧核糖核苷酸链

RNA为核糖核苷酸链


第三节、DNA的结构与功能

一、DNA的双螺旋结构

DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式,它是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型。


  • 碱基的理化数据分析

  • A-T、G-C以氢键配对较合理

  • DNA纤维的X-线衍射图谱分析

DNA双螺旋结构的研究背景


Chargaff法则

本世纪20年代,Levene研究了核酸的化学结构并提出四核苷酸假说;40年代末,Avery,Hershey和Chase的实验严密地证实了DNA就是遗传物质;50年代初,Chargaff应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术,对多种生物DNA作碱基定量分析,发现DNA碱基组成有如下规律:


DNA来源

腺嘌呤(A)

胸腺嘧啶(T)

鸟嘌呤(G)

胞嘧啶(C)

(A+T)/(G+C)

大肠杆菌

25.4

24.8

24.1

25.7

1.0

小麦

27.3

27.1

22.8

22.7

1.21

28.6

28.4

21.4

21.5

1.33

猪:肝

29.4

29.7

20.5

20.5

1.43

胸腺

30.0

28.9

20.4

20.7

29.6

29.2

20.4

20.8

酵母

31.3

32.9

18.7

17.5

1.079

不同生物来源的DNA四种碱基比例关系


DNA的碱基组成规律(Chargaff法则)

1. 同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同;

2. 同一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变;

3. 几乎所有的DNA,无论种属来源如何,其摩尔含量相同[A]=[T],[G]=[C],[A]+[G]=[C]+[T]。

4. 不同生物来源的DNA碱基组成不同,表现在A+T/G+C比值的不同。


DNA的双螺旋结构特征

  • (1)DNA分子由两条反向平行的多聚脱氧核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕,形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反,即其中一条链的方向为5′→3′,而另一条链的方向为3′→5′。


DNA的双螺旋结构特征

  • (2)嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成90°角。

  • (3)螺旋横截面的直径约为2 nm,每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm,每10个核苷酸对形成一个螺旋,其螺矩(即螺旋旋转一圈)高度为3.4 nm。


DNA的双螺旋结构特征

(4)双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。

  • 碱基的相互结合具有严格的配对规律,A-T,G-C结合,这种配对关系,称为碱基互补。A T间形成两个氢键,G C 间 三个氢键。

  • 在DNA分子中,嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。



DNA的双螺旋结构特征

(5)沿中心轴观察,双螺旋结构上有两条螺形凹槽,一条较深宽,称为大沟(宽1.2nm,深0.85nm );另一条浅窄,称为小沟(宽0.6nm,深0.75nm )。

大沟暴露出嘌呤的C6N7和嘧啶C4C5及其取代基团;小沟一侧暴露出嘌呤C2和嘧啶C2及其取代基团。

大沟与小沟对于DNA与蛋白质的相互识别极其重要。


DNA双螺旋的稳定性因素

  • DNA双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。

  • 两条DNA链之间形成的氢键(A=T,G≡C)维持螺旋的横向稳定;

  • 嘌呤碱基与嘧啶碱基形状扁平,呈疏水性,在螺旋内部层层堆积,形成强大的疏水区,消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响,碱基之间这种在垂直方向的作用力被称为碱基堆积力,是维系DNA双螺旋结构稳定的主要作用力;


DNA双螺旋的稳定性因素

  • 介质中的阳离子(如Na+、K+和Mg2+)或富含正电荷的碱性蛋白中和了磷酸基团的负电荷,这种离子键降低了DNA链间的排斥力、范德华引力等。

  • 改变介质条件和环境温度,将影响双螺旋的稳定性。


DNA二级结构的多态性

所谓DNA二级结构的多态性,是指DNA不仅具有多种形式的双螺旋结构,而且还能形成三链等其它结构,说明DNA的结构是动态的,而不是静态的。核酸的构型的多样性是由于核酸主干链上各键和碱基的旋转造成的,是特定的碱基序列导致的结果。


(1) B-DNA螺旋: DNA在92%相对湿度的钠盐中的构型,是细胞正常状态下DNA存在的主要构型。

(2) A-DNA螺旋:DNA在75%相对湿度的钠盐中的构型。

(3) C-DNA螺旋:DNA在66%相对湿度的锂盐中的构型。

(4) Z-DNA螺旋:左手的DNA螺旋,这种螺旋可能在基因表达或遗传重组中起作用。


双螺旋

碱基倾

碱基夹

碱基间距

/nm

螺距

/nm

每轮碱

基数

大沟

小沟

B-DNA

0

36.0

0.34

3.6

10.5

很宽、较深

窄、深

Z-DNA

9

-60.0

0.38

4.6

12

平坦

较窄、很深

A-DAN

20

32.7

0.256

2.8

11

很窄、很深

很宽、浅

C-DNA

6

38

0.331

3.1

9.3

较宽、较深

很窄、很深


DNA的二级结构类型


  • DNA的三级结构是指DNA双螺旋结构通过进一步扭曲和折叠所形成的更加复杂的构象,超螺旋是三级结构的主要形式。

  • 自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来,现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalently closed circle,CCC)分子,这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。


  • 环状DNA主要有以下三种构象:

松弛环形

超螺环形

开链环形


  • 有些单链环形染色体(如φ×174)或双链线形染色体(如噬菌体入),在其生活周期的某一阶段,将其染色体变为超螺旋形式。对于真核生物来说,虽然其染色体多为线形分子,但其DNA均与蛋白质相结合,两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构,类似于CCC分子,同样具有超螺旋形式。

  • 超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生物中,DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时,存在着负超螺旋。研究发现,所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。


超螺旋结构(superhelix 或supercoil)

DNA双螺旋链扭曲或再盘绕所形成空间结构。

正超螺旋(positive supercoil)

DNA双螺旋链盘绕过多时所形成的超螺旋。

负超螺旋(negative supercoil)

DNA双螺旋链盘绕不足时所形成的超螺旋。

意义

DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。


原核生物DNA的三级结构

  • 绝 大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。


真核生物中的核小体结构

  • 在真核生物中,双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕,从而形成特殊的串珠状结构,称为核小体。核小体结构属于DNA的三级结构。


核小体由DNA和组蛋白构成。组蛋白有五种,H2A,H2B,H3,H4 各两分子构成一个八聚体,其外再由双螺旋DNA绕其旋转1.75圈(为DNA的三级结构),约含140bp 。称为核小体的核心颗粒(core particle)。两个核心颗粒之间由一段双螺旋DNA链(约60bp)相连,称为连接部。组蛋白H1结合在此部位。若干个核小体再螺旋形成核小体纤维,再进一步螺旋化形成染色体。从双螺旋DNA到染色体,DNA总共压缩了约8000~10000倍.


  • 回文结构与镜像结构


  • 回文结构中的单链可形成发夹结构


  • 双链回文结构可形成十字架结构


  • 三螺旋结构

多嘌呤-多嘧啶的镜象序列可形成三螺旋结构(H-螺旋或Hoogsteen螺旋): 该螺旋常处在许多真核细胞基因的表达调节区。可能与基因表达的调节有关.



三、DNA的功能

DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息,并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础,也是个体生命活动的信息基础。

基因从结构上定义,是指DNA分子中的特定区段,其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。


第四节、RNA的结构与功能

RNA的主要种类与功能


  • RNA是单股核酸分子,多核苷酸链自身折叠、缠绕,以碱基互补配对原则,在许多区域形成茎环结构,其二级结构中有许多修饰碱基。

RNA单链的折叠


内含子

(intron)

外显子

(exon)

hnRNA

(核不均一RNA)

mRNA

一、信使RNA的结构与功能

* mRNA成熟过程


顺反子

顺反子

顺反子

插入顺序

插入顺序

先导区

末端顺序

原核细胞mRNA的结构特点

先导区+翻译区(多顺反子)+末端序列


AAAAAAA-OH

顺反子

5´“帽子”

尾巴3´

真核细胞mRNA的结构特点

m7GpppNm-

“帽子”(m7GpppNm-)+单顺反子+“尾巴”(Poly A)


1. 真核生物mRNA的前体是核不均一RNA,经 过切除内含子、拼接外显子的加工,形成成熟的mRNA。

2. 大多数真核mRNA的5´末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷,同时第一个核苷酸的C´2也是甲基化,形成帽子结构:m7GpppNm-。

3. 大多数真核细胞mRNA在3‘-末端有一段长约20~200核苷酸的polyA。polyA是在转录后经polyA聚合酶的作用而添加上去的。


OCH3

帽子结构


5´-cap的功能

(1) 防止mRNA被核酸酶降解。

(2) 为mRNA翻译活性所必需。

(3) 与蛋白质合成的正确起始有关。

polyA的功能

(1) 保护mRNA,免受核酸外切酶的作用。

(2) 与翻译有关,没有polyA翻译活性降低。

(3) 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。


  • * mRNA的功能

    • 把DNA所携带的遗传信息,以密码子的形式,按碱基互补配对原则,抄录并传送至核糖体,用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。

  • mRNA分子中带有遗传密码,其功能是为蛋白质的合成提供模板。

  • mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组,在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸,这种核苷酸三联体称为遗传密码(coden)


U

C

A

G

密码子的第三个字母

U

C

A

G

U

C

A

G

U

C

A

G

遗传密码表


二、转移RNA的结构与功能

tRNA一级结构的共同点:

① Mr较小(Mr25000),沉降常数4S。

② 各种tRNA的链长很接近,一般含73~93个核苷酸。

③ tRNA是保守性最强的RNA,

分子中约20多个位置上的核苷酸是不变和半不变的。

④ 各种tRNA的3′端为CCA;5′端大多数为pG,少数为pC。

⑤ tRNA分子中含有较多的修饰成分,达10%-20%。


tRNA二级结构特点:

tRNA是单链核酸,但其分子中的某些局部也可形成双螺旋结构。 tRNA的二级结构由于局部双螺旋的形成而呈现“三叶草”形,故称为“三叶草”结构。

tRNA的“三叶草”形结构包括:氨基酸臂、DHU臂与环、反密码臂与环、可变环和TψC臂与环五部分。


氨基酸臂

TψC臂与环

DHU臂与环

可变环

反密码臂与环


(1)氨基酸接受区包含有tRNA的3’-末端和5’-末端, 3’-末端的最后3个核苷酸残基都是CCA,A为核苷。氨基酸可与其成酯,该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。(2)反密码区与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域,其中正中的3个核苷酸残基称为反密码


(3)二氢尿嘧啶区

该区含有二氢尿嘧啶。

(4) TC区该区与二氢尿嘧啶区相对, 假尿嘧啶核苷—胸腺嘧啶核糖核苷环(TC)由7个核苷酸组成,通过由5对碱基组成的双螺旋区(TC臂)与tRNA的其余部分相连。除个别例外,几乎所有tBNA在此环中都含有TC 。

(5)可变区

位于反密码区与TC区之间,不同的tRNA该区变化较大。


tRNA二级结构的特殊情况

1980年牛心线粒体tRNAser只有63个核苷酸,沉降常数3S,缺少D环和D臂,呈二叶草型。

近年来发现2种线虫线粒体tRNA也不是标准的三叶草结构。


tRNA的三级结构

tRNA的三级结构为倒L型。反密码子环和氨基酸臂两个功能区位于倒L型的两个端点,二氢尿嘧啶区和TC区构成倒L型的拐角。


  • tRNA二级结构中未配对的某些并不互补的碱基参与了三级结构中特殊的氢键作用,tRNA链中的核糖-磷酸骨架与某些碱基甚至其他的骨架之间也能产生作用。


tRNA的主要功能

tRNA的作用是多方面的,它通过高度专一的氨 酰-tRNA合成酶识别、活化、携带相应的氨基酸,将氨基酸转运到核糖体上,识别mRNA上相应的密码子,按照mRNA上的密码顺序,将相应的氨基酸装配到蛋白质的特定位点。

所有的tRNA折叠后形成大小相似及三维构象相似的三级结构,这有利于携带氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位。


三、核糖体RNA的结构与功能

  • rRNA是细胞中含量最多的RNA,占总量的80%。rRNA的主要功能是与蛋白质一起构成核蛋白体,作为蛋白质生物合成的场所。


5sRNA的二级结构

许多rRNA的一级结构及由一级结构推导 出来的二级结构都已阐明,但是对许多rRNA的功能迄今仍不十分清楚。


大肠杆菌16S rRNA的二级结构



四 、其他小分子RNA

除了上述三种RNA外,细胞的不同部位存在着许多其他种类的小分子RNA,如:

  • 核内小RNA(snRNA)

  • 核仁小RNA (snoRNA)

  • 胞质小RNA (scRNA)

  • 催化性小RNA (ribozyme)

  • 小片段干涉RNA (micRNA)


  • 存在于真核生物中的小分子RNA一般含100~300 个碱基,酵母中的小分子RNA可含有上千个碱基;它们在细胞中的数量多达105~106,少则不能直接检测。

  • 许多小分子RNA常与蛋白质结合,以核蛋白的形式发挥作用.例如:核内小RNA ( snRNA )、胞液小RNA ( scRNA )等,它们在自然状态下以核蛋白颗粒snRNP和scRNP形式存在。

  • 一种RNA结合的蛋白质可以是多种,结合的蛋白不同,所具有的功能不同


一、核酸的一般理化性质

第五节、核酸的理化性质极其应用

  • 稳定性

    天然DNA分子长度可达几厘米,而分子直径只有2纳米。这种细丝状的双螺旋结构使DNA在机械力作用下极易发生断裂,RNA分子量小,同样条件下不易断裂。


核酸的磷酸基具有酸性,碱基具有碱性,因此,核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性,其等电点偏酸性。DNA的pI约为4~5,RNA的pI约为2.0~2.5,在pH7~8电泳时泳向正极。


  • 由于核酸中嘌呤碱基和嘧啶碱基具有共轭双键,所以核酸在紫外区具有强烈的吸收性能,最大吸收值在260nm处。这可作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。


260nm光吸收值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA

或相当于40μg/ml单链DNA或RNA

或相当于20μg/ml寡核苷酸。

根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度

纯DNA:A260/A280=1.8

纯RNA:A260/A280=2.0

纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量


纯的DNA白色纤维状固体,纯的RNA白色粉末状固体。 DNA和RNA微溶于水,其钠盐在水中的溶解度较大。能溶于2-甲氧乙醇,不溶于乙醇、乙醚等有机 溶剂中,实验室中常用乙醇沉淀核酸。

核苷是无色的晶体或粉末,熔点较高。在水中的溶解度嘧啶核苷比嘌呤核苷大,在有机溶剂中一般不溶解。


  • 目前核酸的分子量用电子显微镜照相,放射自显影凝胶电泳等技术来测定。

  • 部分核酸分子量和核苷酸数:


由于DNA分子的极度不对称性,因此DNA溶液的粘度极高,比RNA溶液大得多。当核酸溶液因受热或在其他因素作用下发生解旋时,粘度会降低。

  • 旋光性:

    戊糖有不对称的C原子,使其具有旋光性。


溶液中的核酸在引力场中可以下沉,在超速离心机造成的极大的引力场下,核酸分子下沉的速率大大加快。应用超速离心技术,可以测定核酸的沉降常数、分子量和构象。测定DNA分子量时,由于它的粘度大,应采用其稀溶液。


核酸中的 糖苷键和磷酸酯键可被酸水解。糖苷键的稳定性小于磷酸酯键,嘌呤碱的糖苷键稳定性小于嘧啶碱糖苷键。

实验室利用这一特点,通过酸水解测定DNA中的脱氧核糖和RNA中的核糖,进行DNA(二苯胺法)和RNA(地衣酚法)含量测定。


在温和的碱性条件下(0.3mol/LKOH )水解1小时,RNA的磷酸二酯键发生水解,生成2', 3' -环核苷酸,延长反应时间(12-18小时),进一步生成2'-核苷酸和3'-核苷酸。DNA在此条件下稳定不发生水解。

这是因为RNA的核糖上有2' -OH,在碱的作用下易形成磷酸三酯,磷酸三酯极不稳定,随即水解成2', 3' -环核苷酸。DNA为2' -脱氧核糖,因此对碱有抗性。利用此原理可将DNA中的RNA除去。


水解核酸的酶很多,根据专一性不同分磷酸二酯酶(非特异性水解磷酸二酯键)和核酸酶(特异性水解磷酸二酯键)(第六节中介绍)。

1.蛇毒磷酸二酯酶

5-核苷酸



2.牛脾磷酸二酯酶

+

3´-核苷酸

对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反


二、核酸的变性与复性

核酸的变性:在某些理化因素作用下,维持核酸中双螺旋结构稳定的次级键被破坏,双螺旋结构解开成单链的过程。

  • DNA:DNA分子内的氢键断裂,双螺旋结构部分或全部解开,形成两条单链的过程。

  • RNA: RNA仅局部呈双螺旋结构,其螺旋形结构向线团形结构转化不如DNA明显。


引起核酸变性的因素:

酸碱变性:由过量酸、碱引起碱基间氢键破坏。

加热变性:破坏碱基间的氢键。

变性试剂:如尿素、甲酰胺、乙醇、丙酮等。

变性后其它理化性质变化:

OD260增高 粘度下降

比旋度下降 浮力密度升高

酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失


DNA变性的本质是双链间氢键的断裂


变性引起紫外吸收值的改变:

DNA的紫外吸收光谱

  • 增色效应:DNA变性时其溶液OD260增高的现象。

    (双螺旋打开碱基暴露紫外吸收增加)


DNA的复性:

  • 变性DNA在适当条件下(如缓慢冷却),两条彼此分开的单链重新缔合成双螺旋结构的过程称为复性。理化性质和生物学活性完全或部分恢复。

  • 复性过程产生减色效应—紫外吸收值下降。

退火—加热变性的DNA经缓慢降温,重新形成双螺旋的过程。

淬火—加热变性的DNA经迅速降温,不能重新形成双螺旋的过程。


DNA的变性和复性


DNA复性的影响因素:

  • 温度与时间:一般认为比50%变性温度(紫外吸收值升高一半时的温度)低25℃是复性的最佳温度。

  • DNA浓度:DNA浓度愈高,愈易复性。

  • DNA序列的复杂度:DNA分子量大,序列复杂,复性所需时间越长( Cot1/2 越大)。通常用Cot1/2表示DNA分子复杂度。

Cot 1/2 :即指复性完成一半时的Cot值。

C0:t=0时,起始DNA的浓度(mol/L)

t:复性时间(sec)


核苷酸对

重缔合的比例

不同DNA的复性时间


三、DNA的熔解温度

变性是在一个相当窄的温度范围内完成,在这一范围内,紫外光吸收值达到最大值的50%时(或50%DNA发生变性时)的温度称为DNA的解链温度,又称融解温度(melting temperature, Tm)。通常用Tm表示。


影响Tm值的因素 :

一般DNA的Tm值在82-95C之间。每种DNA都有特征Tm

① DNA的均一性 :

均一的DNA,Tm范围较窄。

② DNA中G-C对的含量:

G+C含量越高,Tm值越大。

经验式:

(G-C)%=(Tm-69.3)×2.44

③ 盐离子强度:

低离子强度介质中,DNA的Tm低,温度变化范围较宽。因此,通常将DNA 保存在高浓度的盐溶液中。


四、核酸的杂交极其应用

核酸的杂交:是指不同来源的单链核酸之间通过碱基互补形成双螺旋结构的过程。所形成的杂合双链分子称为杂交分子。

杂交分子种类:DNA1-DNA2、DNA-RNA、RNA1-RNA2。一般可通过热变性-退火复性获得。

应用:利用核酸杂交可检测特定的核酸片段、基因定位或研究DNA同源性等。


复性

变性

不同来源的DNA分子

DNA-DNA

杂交双链分子


用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交

探针:作为检测用的已知DNA序列或RNA序列的片段


第六节、核酸酶和限制性核酸内切酶

一、核酸酶的分类及特异性

  • 按底物专一性:核糖核酸酶(ribonuclease, RNase)和脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)

  • 按作用方式:核酸内切酶(endonuclease)核酸外切酶(exonuclease)

  • 按磷酸二酯键断裂的方式:水解3'-OH与磷酸之间的酯键,产物为5'-核苷酸;水解5'-OH与磷酸之间的酯键,产物3'-核苷酸。

  • 其它:如双链酶、单链酶等


二、核酸酶的功能

生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解

  • 参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程

  • 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸,同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸

  • 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收

  • 体外重组DNA技术中的重要工具酶


核糖核酸酶T1(RNase T1)

核糖核酸酶T2(RNase T2)

C

A

U

G

A

G

主要作用点为Ap残基,水解速度A>>U>G>C


三、限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶来自于细菌,主要降解非细菌体内的外源未经特殊修饰的双链DNA,对自身起保护作用。它识别及切割的位点常具有回文结构。


限制性内切酶的特征:

① 具有严格的碱基专一性,有专一的识别顺序、切点。

② 产物具粘性未端或平整末端。

粘性末端--指切割产物片段两端突出的单链具有互补序列。

限制性内切酶的命名:

E-大肠杆菌E.coli属名的第一个字母

co-种名的头两个字母

EcoRI

R-所用大肠杆菌E.coli的菌株

Ⅰ-从该细菌中分离出的这一类酶的编号


限制性核酸内切酶的类型:

Ⅰ型:催化反应需要ATP,同时具有限制酶和甲基化酶两种活性,切点距识别序列约1000bp。

Ⅱ型:反应不需要ATP,在所识别的特殊核苷酸序列内或附近切割DNA链,通常识别位点是由4或6核苷酸组成的回文结构。酶分子本身由两个完全一致的亚基组成,分子量小于80ku,Mg2+是唯一的辅助因子。

是目前被广泛应用于分子生物学的一类酶。

Ⅲ型:反应需要ATP,同时具有限制酶和甲基化酶两种活性,切点距识别序列约10-25bp。



第七节、DNA一级结构测定与

DNA的化学合成

一、 DNA一级结构测定

英国Sanger 1975年加减法,1977年末端终止法

美国Maxam和Gilbert 1977年化学断裂法

二、 DNA的化学合成

阅读内容,自学。


双脱氧法(末端终止法、酶法):

1.平行进行四组反应。

2.加入相同的单链DNA模板、引物、四种dNTP及DNA聚合酶。合成新的互补DNA链。3.每组另外再分别加入一定比例的2’,3’-双脱氧NTP(如ddATP),使反应随机终止于dd NTP 处。

4.任意选取一种脱氧核苷酸为同位素标记物,便于检测。

5.加热变性,凝胶电泳分离,放射自显影检测。


化学断裂法(化学切割法):

1、首先分离纯化一条DNA链,并用32P标记该链5末端 。

2、反应分四组,选择专一性不同的试剂分别破坏四种碱基中的一种,控制反应条件(温度,pH等),使磷酸核糖骨架在此处断裂。

嘌呤碱基:硫酸二甲酯与哌啶配合使用,在嘌呤碱基处发生断裂。

嘧啶碱基:肼与哌啶配合使用,在嘧啶碱基处发生断裂。

3、凝胶电泳分离,放射自显影检测。


A

G

C

T

同位素标记:

5-pGCTACGTA-3

化学裂解:

5-p32GCTACGTA-3

在A切断:

5-p32GCTACGT-3

5-p32GCT-3

在G切断:

5-p32GCTAC-3

在C切断:

5-p32GCTA-3

5-p32G-3

直接读到的碱基顺序是:

5-p32CTACGTA-3

在T切断:

5-p32GCTACG-3

5-p32GC-3


第八节、基因和基因组

一、基因

决定和影响生物体一种性状或一个表现型的染色体上的一部分。

一个基因一个酶

一个基因一条肽链

为各种多肽链或RNA序列编码的DNA片段,又称结构基因。起调节作用的DNA片段称为调节序列。


二、基因组

定义:一个生物体的全部基因序列称为基因组。

  • 病毒基因组结构特点:

    1、基因组相对较小且大小相差较大。

    2、不同病毒只含一种不同结构核酸。

    3、由连续的或不连续的多核苷酸链组成。

    4、基因重叠(包含型、交叉型)。

    5、大部分用来编码蛋白质(相关基因簇、单倍体基因组、与寄主基因组结构特征相似)。


1、染色体基因组通常只由一条环状双链DNA组成。

2、具有操纵子结构。

3、重复序列少。

4、内含子所占比例小。

5、具有编码同工酶的同基因。

6、基因不重叠。

7、具有多种功能的识别区域。

8、在基因或操纵子序列末端具有特殊终止序列。


1、体细胞的基因组是双份的

真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体,储存于细胞核内,除配子细胞外,体细胞内的基因组是双份的(即双倍体,diploid),即有两份同源的基因组。

2、转录产物是单顺反子

即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子,一条多肽链。


3、存在大量重复序列

存在大量重复序列,即在整个DNA中有许多重复出现的核苷酸顺序,重复序列长度可长可短,短的仅含两个核苷酸,长的多达数百、乃至上千。重复频率也不尽相同:

(1) 高度重复序列:重复频率可达106次,约5~100bp,这种序列G-C含量高于DNA的其它结构,因此在氯化铯密度梯度离心时,常在DNA的主峰旁显示一个小峰,此小峰称为卫星峰,故将这部分DNA称为卫星DNA。


2) 中度重复序列:重复频率可达103~104次,长度约100~300bp,rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因等,大多为中度重复序列。此外在这类重复序列中,还有一类可移动的片段,称为逆转座子(retroposon),它们可能在进化过程中发挥重要作用。

(3) 单拷贝或低度重复序列:指在整个基因组中只出现一次或很少几次的核苷酸序列。在真核细胞中,除组蛋白以外,其它所有蛋白质都是由DNA中这种单拷贝序列决定的。这种序列大小不等,每一个顺序决定一个蛋白质的结构,称之为结构基因。在人基因组中占约60~65%,因此所含信息量最大。


4、有很多不编码区域

5、基因是不连续的

在真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质的间隔序列(intervening sequences),称为内含子(intron),编码区则称为外显子(exon)。内含子与外显子相间排列,转录时一起被转录下来,然后RNA中的内含子被切掉,外显子连接在一起成为成熟的mRNA,作为指导蛋白质合成的模板。

6、具有多个复制起点


第九节、核酸的分离提取和纯化

  • 为保持核酸的生物活性,分离、分析必须在温和条件下进行,防止过酸 、过碱、强烈搅拌。

核酸的纯化方法


DNA的分离

  • 核蛋白的提取:真核细胞中DNA常和组蛋白结合以核蛋白形式存在,把真核细胞捣碎后加入0.9%NaCl和0.01M柠檬酸钠溶液,使DNA蛋白质沉淀,而柠檬酸钠是起抑制DNA的降解作用。

  • 核酸与蛋白质的分离:利用核蛋白溶于1mol /L NaCl的性质,将其从细胞匀浆中分离出来,用饱和苯酚等溶剂与上述核蛋白共振,冰冻离心。 DNA溶于上层水相中,变性蛋白留在酚层内。在水相加入2.5倍体积无水乙醇,将其沉淀出来,再以核酸酶水解以除去RNA。最后借助密度梯度平衡超速离心法或层析柱法,分离DNA。


DNA的精制:制得的DNA中还含少量蛋白质等杂质,将它溶解在蒸馏水中,加入阴离子去污剂硫酸十二酯钠进一步作用于DNA和蛋白,使蛋白质与核酸分离而沉淀,通过高速离心去掉蛋白质,在上层DNA溶液加入95%乙醇沉淀DNA,经过乙醇重复洗几次,可得DNA精制品。


RNA的分离

  • 核蛋白的提取:将细胞破碎制成匀浆,再用0.14mol /L NaCl溶液将细胞质的核糖核蛋白体抽提出来,留下含DNA的细胞核组织,核糖核蛋白可在pH4.5溶液中沉淀析出。

  • 核酸和蛋白质的分离:含水的酚能沉淀蛋白质,核酸和多糖则溶于水层。水层中的RNA和多糖可被乙醇沉淀,将沉淀再溶于磷酸盐缓冲液,然后用-甲氧乙醇抽提RNA,用乙醇沉淀得RNA。


RNA的精制: 在粗制的RNA中加入磷酸盐,醋酸盐,乙二醇甲醚并搅拌,使多糖类物质溶于水里,RNA溶于乙二醇甲醚内,静置分层。从上层乙二醇甲醚取出加醋酸钠,用十六烷基三甲基溴化胺盐使 RNA 沉淀,经离心分离得RNA。


定磷法

  • 将试剂用浓硫酸或过氯酸消化,使核酸磷转化成为无机磷酸。磷酸能与钼酸铵反应生成磷钼酸铵,它在还原剂存在下,可被还原生成钼蓝,再通过测定无机磷酸测定核酸。

  • 通常RNA平均含磷9.4%,而DNA含磷9.9% 。这样可从含磷量推算出核酸的含磷量。


紫外线吸收法

  • 利用核酸组分嘌呤环、嘧啶环具有紫外吸收的特性,在260nm下,每ml含1µg DNA的消光值(O.D.260)为0.020,每ml含1ug RNA的消光值为 0.022,由未知溶液的消光值可计算出其中核酸含量。


定糖法

  • RNA与浓硫酸共热会降解,生成的核糖进而转化为糖糠,它与地衣酚在CuCl2或FeCl3催化下反应呈鲜绿色,在670nm处呈现最大光吸收。

  • DNA经加热酸解后,水解所得的脱氧核糖转变为ω-羟-γ-酮戊醛,再与二苯胺生成蓝色物质。在595nm处呈现最大光吸收。

  • RNA和DNA在20~200µg/ml浓度时,光密度与核酸的浓度呈正比。


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