第二章
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第二章. 提取、分离和鉴别方法. 第二章 提取、分离和鉴别方法. 目的要求 一、天然药物有效成分提取分离方法的原理 — 溶剂提取法与水蒸气蒸馏法的原理、操作及其特点。 二、天然药物有效成分分离与精制 —— 中草药有效成分各种分离方法的原理。 三、掌握色谱技术中洗脱剂选择的原则。 重点:讲解各种层析方法(硅胶、聚酰胺、葡聚糖凝胶、离子交换树脂、大孔树脂法及分配层析)和两相溶剂萃取法的原理及方法。 难点:讲解各种层析方法和两相溶剂萃取法的原理。. 第一节 提取方法与技术.

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第二章

提取、分离和鉴别方法


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第二章 提取、分离和鉴别方法

目的要求

一、天然药物有效成分提取分离方法的原理—溶剂提取法与水蒸气蒸馏法的原理、操作及其特点。

二、天然药物有效成分分离与精制——中草药有效成分各种分离方法的原理。

三、掌握色谱技术中洗脱剂选择的原则。

重点:讲解各种层析方法(硅胶、聚酰胺、葡聚糖凝胶、离子交换树脂、大孔树脂法及分配层析)和两相溶剂萃取法的原理及方法。

难点:讲解各种层析方法和两相溶剂萃取法的原理。


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第一节 提取方法与技术

一、溶剂提取法(extraction with solvent)

1.相似相溶原理:根据相似者相溶原理,选择与化合物极性相当的溶剂将化合物从植物组织中溶解出来。同时,由于某些化合物的增溶或助溶作用,其极性与溶剂极性相差较大的化合物也可溶解出来。

理想溶剂(ideal solvents ):

(1)对有效成分溶解度大;

(2)对无效成分溶解度小;

(3)与有效成分不起化学反应;

(4)安全,成本低,易得。


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第二章 提取分离方法

二、溶剂提取法的提取过程

将适宜的溶剂加入到药材中,溶剂通过渗透 扩散进入到细胞中,溶解可溶性成分。形成细胞内外浓度差,产生渗透压,细胞内溶质向细胞外扩散,最后达到动态平衡,细胞外溶剂就溶解了大量溶质,从而把大量有效成分提取出来。


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第一节 提取分离方法

三、常用溶剂的特点:

环己烷,石油醚,苯,氯仿,乙醚,乙酸乙酯,正丁醇,丙酮,乙醇,甲醇

极性:小 ——————大

亲脂性:大 —————— 小

亲水性:小 —————— 大

(1)比水重的有机溶剂:氯仿。

(2)与水分层的有机溶剂:环己烷 ~ 正丁醇。

(3)能与水分层的极性最大的有机溶剂:正丁醇。

(4)与水可以任意混溶的有机溶剂:丙酮 ~ 甲醇。属于亲水性溶剂。

(5)极性最大的有机溶剂:甲醇

(6)极性最小的有机溶剂:环己烷

(7)介电常数最小的有机溶剂:石油醚

(8)常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的有机溶剂:正丁醇

(9)溶解范围最广的有机溶剂:乙醇


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第一节 提取方法与技术

1、冷提:适用于受热不稳定的成分。

浸渍 (Maceration)

渗漉(Percolation)

Simple percolate assembly


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第一节 提取方法与技术

工业生产用的渗漉装置


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第一节 提取方法与技术

2、热提:煎煮法(Decoction)

回流(Refluxing)

连续回流(Continuous Refluxing)

Assembly of Soxhlet extractor

Simple refluxing assembly


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第一节 提取方法与技术

2.水蒸气蒸馏法(water-steam distillation )

提取具有挥发性,能随水蒸气

蒸馏而不被破坏的成分,如挥发油。

Simple water-steam distillation refluxing assembly


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第一节 提取方法与技术

3.升华法( sublimation )

用于具有升华性的成分提取,如香豆素,蒽醌,樟脑等。


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第一节 提取方法与技术

4.超临界流体提取法(supercritical fluid extraction

SFE)

利用溶剂在超临界条件下特殊的流体性能对样品进行提取,为20世纪80年代迅速发展起来的一种提取方法。

  • 超临界流体的密度与液体很接近,而它又具有气体扩散性能

  • 常用的临界流体有CO2、N2O、 乙烷、丙烷等。


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萃取柱

CO2

CO2

流量计

冷温槽

P

超临界萃取实验装置与实验方法

实验装置-小试实验装置

超临界CO2萃取实验装置示意图

控温面板

高压泵

小试实验装置图


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  • 上世纪50年代初进入试验阶段,如从石油中脱沥青

  • 70、80年代,SFE越来越多的用于食品、香料的提取

  • 90年代,开始从植物药中提取成分,如蛇床子、茵陈蒿、桑白皮中提取成分。

中小型SFE装置图


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第一节 提取方法与技术

5.超声提取法(ultrasonic extraction)

为物理过程,无化学反应,生物活性不减。大能量的超声波产生的极大压力造成植物物细胞壁及整个生物体破裂,胞内物质的释放、扩散及溶解。

实验室用小型超声仪


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工业生产用超声仪


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第一节 提取方法与技术

6.微波提取法(microwave extraction)

  • 具有穿透力强、选择性高、加热效率高等显著特点,而且其操作简便、快速、节能、高效。

  • 缺点:工业化设备少、成分变化、生物活性变化。

工业生产用微波提取罐


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第二节 分离与精制

二、分离方法

一 、系统溶剂分离法:

1、此法是选用3—4种不同极性的溶剂由低级性到高极性分步对上述总提取液进行提取分离,是提取物中各组分按其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。

2、在中草药提取液中加入另一种溶剂以改变混合物溶剂的极性,使一部分物质沉淀析出,从而实现分离。如:水—醇法除多糖、蛋白质等水溶性杂质;醇—水法除树脂、叶绿素等水不溶性杂质;醇—醚法或醇—丙酮法使苷类成分,而脂溶性树脂等杂质则存留在母液中。


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第二节 分离与精制

二、分离方法

一 、两相溶剂萃取法

(1)原理:利用混合物中各成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数的不同而实现分离。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大,则分离效率越高。

①分配系数K值(即分配比):溶质在两相溶剂中的分配比(K)在一定温度及压力下为一常数


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第二节 分离与精制

2.根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离

2.1 影响分离的因素

①分离因子β,分配系数K

β= KA/ KB KA>KB,

K=CU/CL

(CU, CL被分离物质在上相和下相中浓度)

根据β值的大小可决定分离采用的方法:

β≥100,简单的一次萃取,可基本分离.

100>β≥10,10-12次萃取,CCD法。

β≤2,100次以上萃取,DCCC法。


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第二节 分离与精制

或用PC法求β值,选择理想分离条件。

  • 纸色谱(PC)也叫纸分配色谱(PPC, Paper Partition Chromatography)。

( 纸色谱定数)

=

Rfa,Rfb为A,B两物质在PC上Rf值


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第二节 分离与精制

  • 2.1 影响分离的因素

    ② pH值

    对于酸性、碱性、两性化合物,pH值可改变它们的存在状态(游离型和解离型),分配比受pH值的影响,因为

HA达到99%解离时,pH= pKa + 2

HA达到99%游离时,pH= pKa - 2


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第二节 分离与精制

2.2 酸碱性成分的分离—pH-梯度萃取法

按酸碱性强弱不同分离酸性、碱性、中性物质,改变pH值使酸碱成分呈不同状态。

2.3 逆流分溶法、液滴逆流色谱、高速逆流色谱

①逆流分溶法(CCD):

多次连续液-液萃取分离过程。

特点:条件温和,样品易回收,适用于中等极性、不稳定物质的分离。


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第二节 分离与精制

②液滴逆流色谱(DCCC):

一种液-液分配色谱,流动相呈液滴形式垂直上升或下降,通过固定相的液柱,实现物质的逆流色谱分离。

特点:不易乳化,样品可定量回收,分离效果好,特别适合于分离皂苷等水溶性成分。

缺点:样品处理量小。


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第二节 分离与精制

③高速逆流色谱(HSCCC)

通过特定的高速行星式旋转所产生的离心力场

作用,使无载体支持的固定相稳定地保留在蛇形管

内,并使流动相单向、低速通过固定相,实现连续

逆流萃取分离物质的目的。

用于各种物质的分离,包括蛋白、酶、三萜、生

物碱、皂苷等。


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第二节 分离与精制

三、沉淀法

  • 1、酸碱沉淀法:利用某些成分在酸中或碱中溶解,又在碱中或酸中沉淀的性质达到分离。对酸性、碱性或两性有机化合物来说,通常通过加入酸、碱以调节溶液的pH,以改变分子的存在状态(游离型或解离型),从而改变溶解度而实现分离。如:酸提碱沉法,碱提酸沉法等

  • 2、试剂沉淀法:在天然产物的提取液中,加入某些试剂,使与有效成分结合而产生沉淀,借此进行分离。该方法与简单萃取法相配合即析出被另一相不相混溶的有机溶剂。

  • 3、铅盐沉淀法:利用有效成分或杂质能与铅离子形成难溶性盐,从而使有效成分与杂质分开,本方法可用来沉淀杂质,也可用来沉淀有效成分。例如鞣质的提取分离。酸性或碱性化合物还可通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类沉淀等析出。如加入铅盐、雷氏铵盐等


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第二节 分离与精制

  • 四、吸附法:

  • 分两种情况,一种是吸附杂质,另一种是吸附有效成分。常用吸附剂有,氧化铝、氧化镁、酸性白土、活性炭等。从活性炭上洗脱被吸附的物质时,溶剂的极性越小,洗脱能力越强。


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第二节 分离与精制

  • 五、盐析法:

  • 在提取液中,加入无机盐,使其达到一定浓度或饱和,促使有效成分在水中溶解度降低,而沉淀析出,使有效成分与其他水溶性较大的杂质分离。


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第二节 分离与精制

  • 六、透析法:

  • 透析法是膜过滤法中的一种。

  • (1)原理:透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜、而大分子物质不能透过半透膜的性质,以达到分离的目的,本质上是一种分子筛作用。

  • (2)应用:对于生物大分子,一般可以通过透析法进行浓缩和精制。如药用酶的精制。

  • 分离和纯化皂苷、蛋白质、多肽、多糖等大分子物质,可将其留在半透膜内,而将如无机盐、单糖、双糖等小分子的物质透过半透膜,进入膜外的溶液中,而加以分离精制。


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第二节 分离与精制

  • 七、升华法

  • 也可以用于提取。


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第二节 分离与精制

  • 八、分馏法:根据物质的沸点进行分离

  • 1.概念: 分馏法是利用中药中各成分沸点的差别进行提取分离的方法。一般情况下,液体混合物沸点相差100℃以上时,可用反复蒸馏法;沸点相差25℃以下时,需用分馏柱;沸点相差越小,则需要的分馏装置越精细。

  • 2.应用:挥发油、一些液体生物碱的提取分离常采用分馏法。


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第三节 结晶及重结晶法

  • 原理:利用不同温度可引起物质溶解度的改变的性质以分离物质。a将不是结晶状态的固体物质处理成结晶状态的操作称结晶;b将不纯的结晶进一步精制成较纯的结晶的过程称为重结晶。

  • 一溶剂选择的一般原则:

  • 1不反应;

  • 2冷时对所需要的成分溶解度较小,而热时溶解度较大;对杂质溶解度很大或很小;

  • 3沸点低,易挥发;

  • 4无毒或毒性小;

  • 5若无理想的单一溶剂时,可以考虑使用混合溶剂;

  • 6一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。


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第三节 结晶及重结晶法

  • 二、结晶操作:

  • 结晶操作实际是进一步分离纯化过程:一般是应用适量的溶剂在加热至沸点的情况下将化合物溶解,制成过饱和溶液,趁热过滤去除不溶性杂质,放置冷处,以析晶。


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第三节 结晶及重结晶法

  • 三、结晶纯度的判定:

  • 1、结晶形态和色泽:单一化合物的结晶具有结晶形状均一和均匀的色泽。

  • 2、熔点和熔距:单一化合物具有一定的熔点和较小的熔距,结晶前后的熔点应一致,熔距很窄,在1℃(2℃的范围内。但要注意双熔点,如汉防己乙素、芫花素及一些与糖结合的苷类化合物。

  • 3、色谱法:单一化合物在薄层色谱或纸色谱层析中经三种不同的溶剂系统展开,均为一个斑点者为单一化合物。

  • 流动相:固定相饱和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂。

  • 洗脱顺序:化合物极性越小,越先出柱;反之,化合物极性越大,越后出柱。

  • 应用:通常用于分离水溶性或极性较大的成分,如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。


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第四节 色谱分离法

  • 一、吸附色谱法

  • 利用同一吸附剂对混合物中各成分吸附能力的差异而使各成分达到分离的色谱方法。特别适用于脂溶性中等分子量成分的分离。其中以固——液吸附用的最多,并有物理吸附(硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行的吸附色谱)、化学吸附(黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生物碱被酸性硅胶吸附等)及半化学吸附(聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附,吸附力较弱,介于物理吸附与化学吸附之间)之分。


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第四节 色谱分离法

  • 1.物质的吸附规律:

  • (1)物理吸附过程一般无选择性,但吸附强弱大体遵循“相似者易于吸附”的经验规律。

  • (2)被分离的物质与吸附剂、洗脱剂共同构成吸附层析的三要素,彼此紧密相连。

  • 2.极性及其强弱判断:

  • (1)一般化合物的极性按下列官能团的顺序增强:

  • —CH2—CH2—,—CH2=CH2—,—OCH3,— COOR,>C=O,—CHO,

  • —NH2,— OH,—COOH

  • (2)溶剂的极性可大体根据介电常数的大小来判断。介电常数越大,则极性越大。一般溶剂的介电常数按下列顺序增大:

  • 环己烷(1.88),苯(2.29),无水乙醚(4.47),氯仿(5.20),乙酸乙酯(6.11),乙醇(26.0),甲醇(31.2),水(81.0)


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第四节 色谱分离法

  • 3.吸附柱色谱法用于物质的分离:

  • 以硅胶或氧化铝为吸附剂进行柱色谱分离时:

  • (1)尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解样品,或用极性稍大的溶剂溶解样品后,以少量吸附剂拌匀挥干,上柱。

  • (2)一般以TLC展开时使组分Rf值达到0.2-0.3的溶剂系统作为最佳溶剂系统进行洗脱。实践中多用混合的有机溶剂系统。

  • (3)为避免化学吸附,酸性物质宜用硅胶、碱性物质宜用氧化铝作为吸附剂进行分离。通常在分离酸性(或碱性)物质时,洗脱溶剂中常加入适量的醋酸(或氨、吡啶、二乙胺),以防止拖尾、使斑点集 中。


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第四节 色谱分离法

2.4 液-液分配柱色谱

  • ①正相色谱:固定相极性大,如水、缓冲液等;流动相极性小,如氯仿、乙酸乙酯等。

    载体:硅胶(含水可达17%),硅藻土,纤维素等。

    分离极性大或水溶性成分,如苷类、糖、生物碱等。

    洗脱顺序:极性小的物质先被洗脱出来。


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第四节 色谱分离法

(一)基本原理:

各种吸附剂的表面都存在着吸附活性,对有机化合物表现出不同程度的吸附能力,用一定的溶剂系统展开,溶剂与混合物各成分竞争吸附活性表面,因而就会发生吸附和解吸附的过程,吸附能力差的物质易被解吸附,从而随溶剂先流出,吸附能力强的物质,不易被解吸附,从而后流出,流出先后顺序与吸附强弱有关。

吸附色谱法的分离效果如何,完全由吸附剂、溶剂和被分离物质的性质决定的。


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第四节 色谱分离法

2.4 液-液分配柱色谱

  • ②反相色谱:固定相极性小于流动相。如HPLC反相柱,反相板。

    固定相:硅胶硅醇基结合烷基,如RP-2,RP-8,

    RP-18。亲脂性:RP-18 >RP-8 >RP-2。

    流动相(洗脱剂):MeOH-H2O,CH3CN-H2O

    洗脱顺序:分离极性大的成分,极性大者先洗脱

    下来。


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第四节 色谱分离法

3.根据物质的吸附性差别进行分离——吸附色谱法

3.1 吸附分类:

  • 物理吸附:无选择性的吸附,吸附-解析发生迅速。吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭等;

  • 化学吸附:不可逆性。如碱性氧化铝对酚酸性成分的吸附,硅胶对生物碱的吸附等。

  • 半化学吸附:聚酰胺对酚酸类、醌类的氢键吸附。


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第二节 分离与精制

吸附原理:相似相吸

影响吸附过程的三要素:

吸附剂(固定相),

溶质(被分离物质),

溶剂(洗脱剂,展开剂,流动相)


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第二节 分离与精制

3.2 硅胶、氧化铝:

极性吸附剂:载样量大,吸

附力强

硅胶:应用最广,适用于各

类成分分离

氧化铝:有中性、酸性、碱

性氧化铝。碱性氧化铝不适合

于分离酸性成分,多用于分离

生物碱。


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第二节 分离与精制

3.2 硅胶、氧化铝:

①被分离物质吸附力与结构的关系

被分离物质极性大,吸附力强,Rf值小,洗脱难,

后被洗脱下来。

官能团极性大小排列顺序:

-COOH > Ar-OH > R-OH > R-NH2, RNHR ', RNR ' R " > R-CO-NR'R"> RCHO > RCOR ' > RCOOR ' > ROR ' >RH


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第二节 分离与精制

3.2 硅胶、氧化铝:

②溶剂(洗脱剂)的极性与洗脱力的关系

洗脱剂极性越大, 洗脱力越强.


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第二节 分离与精制

练习: 从黄花夹竹桃果仁中分离到七种强心苷成分, 比较极性大小和硅胶柱上洗脱顺序.

单乙酰黄夹次苷B R”=COCH3, 其它R”=H


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第二节 分离与精制

答案:

1. 极性大 小:黄夹苷A>黄夹苷B >次苷D>次苷C>次苷A>次苷B

2. 硅胶柱上的出柱顺序:后 先


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第二节 分离与精制

3.2 活性炭——非极性吸附剂

  • ①吸附力与结构的关系

    分子量大者 > 分子量小者

    芳香族> 脂肪族

    含OH, COOH, NH2多者> 少者

  • ②洗脱力与溶剂的关系

    吡啶 > 15%酚/醇 > 7%酚/H2O > 醇 > 含水醇>H2O

  • ③应用: 黄酮、生物碱的富集,糖的分离、脱色等。


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第二节 分离与精制

3.4 聚酰胺(Polyamide) 是由己酰胺聚合成的一类高分子化合物。

分离原理:主要通过酰胺键与酚羟基、酸、醌等形成氢键,产生吸附作用。吸附力取决于形成氢键缔合的能力。


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第二节 分离与精制

3.4 聚酰胺

①吸附力与结构的关系

a.形成氢键的基团数目越多, 吸附力越强;

b.形成分子内氢键者, 吸附力减少;


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第二节 分离与精制

3.4 聚酰胺

①吸附力与结构的关系

c.芳香化程度越高或共轭键越多,吸附力越强;

d.芳香苷苷元>苷, 单糖苷>双糖苷>叁糖苷

②溶剂的洗脱能力

水 <含水醇<醇 <丙酮<NaOH/H2O<甲酰胺<二甲基甲酰胺<尿素/H2O


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第二节 分离与精制

3.4 聚酰胺

③常用溶剂: H2O ,EtOH/ H2O,EtOH

④应用:分离黄酮类;除鞣质.


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第二节 分离与精制

练习: 某植物中分得3个黄酮化合物,结构如下, 比较它们的极性大小及在硅胶TLC和聚酰胺薄膜上Rf值大小顺序.

A: R1 =R2= H

B: R1 = H, R2= Rham

C: R1 = Glc, R2= Rham

极性大小:

SiO2-TLC Rf:

Polyamide TLC, Rf:


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第二节 分离与精制

答案:

极性大小: C > B >A

SiO2-TLC Rf: A > B > C

Polyamide TLC, Rf: C > B >A


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第二节 分离与精制

3.5 大孔吸附树脂(macro-reticular resin)

①组成: 苯乙烯,二乙烯苯和致孔剂

②分离原理:吸附(范德华力和氢键)和分子筛作用(多孔性结构)

③树脂类型:非极性、中极性和极性三种。

非极性:由苯乙烯和二乙烯苯缩合而成,故又称

芳香吸附树脂。

中极性:含脂基的吸附树脂。

极 性:含酰氨基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫不同极性功能的吸附树脂。


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第二节 分离与精制

3.5 大孔吸附树脂

④洗脱剂: H2O 及不同比例的含水醇。

洗脱分离:

H2O 洗: 糖,水溶性色素

30% EtOH/ H2O: 极性大的成分

50-75% EtOH: 皂苷类

95% EtOH: 极性小成分

⑤应用: 除多糖, 水溶性色素, 富集苷类成分


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第二节 分离与精制

4.根据物质离解程度不同进行分离—离子交换法

固定相:离子交换树脂(聚苯乙烯高分子化合物,引

入交换基团)

分类:

阳离子交换树脂:强酸型 RSO3-H+

弱酸型 RCOO-H+

阴离子交换树脂:强碱型 RN+(CH3)3Cl-

弱碱型 RNH2, RNHR’, RNR’R”


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第二节 分离与精制

4.根据物质离解程度不同进行分离—离子交换法

4.1交换原理:

阳离子交换树脂:

阴离子交换树脂:

4.2应用:

主要用于生物碱和有机酸的分离。


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第四节 提取分离方法

5.根据物质分子大小差别进行分离—凝胶滤过法

5.1 主要的几种方法

透析法: 半透膜, 分子筛滤过作用

超滤法: 分子大小不同, 扩散速度不同

超速离心法: 溶质在超速离心作用下具有不同的

沉降性或浮游性

凝胶滤过法: 分子筛的作用(凝胶渗透色谱,分子

筛滤过, 排阻色谱), 被分离物质按分子

由大到小的顺序流出色谱柱.


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第四节 提取分离方法

5.根据物质分子大小差别进行分离—凝胶滤过法

5.2凝胶种类:

①葡聚糖凝胶(Sephadex G):

只适于在水中应用, 分离多糖、 蛋白质等.

②羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-10):

适用于各类化合物的分离,除具有分子筛的特性外,还起到反相分配色谱的效果。

常用溶剂有甲醇、氯仿-甲醇等。


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本 章 内 容

第一节 绪论

第二节 各类成分简介

第三节 生物合成

第四节 提取分离方法

第五节天然产物化学成分结构测定


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第五节 结构研究法

一 化合物纯度的鉴定(Identification of Purity)

1. 测熔点: 看熔程

2. 外观结晶色泽与形状: 均一性

3. 色谱法: TLC 三种组成不同的溶剂系统, 单一斑点;

HPLC 单一峰

GC 单一峰

4. 核磁法:不主张。


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第五节 结构研究法

二、已知化合物鉴定(Known compounds)

1. 有标准品(或对照品):

Co-TLC (共薄层,三种系统)

测混合熔点(相同溶剂结晶);

测IR (考察是否重叠)

2. 无标准品:

与文献值对照(相同的溶剂条件下:mp, IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR等)。


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第五节 结构研究法

三、未知化合物 -多种谱学结合的结构解析

1.紫外光谱(Ultraviolet spectra UV)

①为结构解析提供的信息

用于判断结构中的共轭系统、结构骨架(如香

豆素、黄酮)

UV谱一致,不一定是一个化合物。

②应用:确定平面的结构骨架,立体结构的构型、

构象。


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第五节 结构研究法

2. 红外光谱(Infrared spectra IR)

①为结构解析提供的信息

提供各种官能团的信息

八大区(复习)

如:芳香环:  1600-1480cm-1,

OH:  >3000 cm-1,

C=O :  1700 cm-1.

IR相同者为同一化合物.


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第五节 结构研究法

3.质谱(Mass spectra MS)

①为结构解析提供的信息

给出分子量(M+), 给出基团或片段信息, HR-MS可计算分子式;

MS图一致(同一型号仪器,同一条件)一般为同一化合物。

②类型

EI-MS: 醇、糖苷不能给出分子离子峰;

FD-MS、FAB-MS、ESI-MS :用于糖苷,肽,核酸类,可确定分子量。

HR-MS:给处精确的分子量和分子式。


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第五节 结构研究法

4. 核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance NMR)

4.1 质子谱(1H-NMR)

①为结构解析提供的信息

化学位移:  (用于判断H的化学环境 chemical shift);

偶合常数: J (Hz) 用于判断H与H的关系 coupling constant)

积分强度(积分面积): 确定H的数目.


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J=8.0Hz 存在偶合


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第五节 结构研究法

4. 核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance NMR)

4.1 质子谱(1H-NMR)

②常见基团的化学位移值:

Ar-H :6-8,

-CHO :9.8

-CH3:1-1.5,

C=C-CH3, -COCH3, -ArCH3 :1.9-2.5

-OCH3 :3.5-4.0,

-COOCH3与ArOCH3 :3.7-4.0


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第五节 结构研究法

4. 核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance NMR)

4.1 质子谱(1H-NMR)

③影响化学位移因素

化学位移值与电子云密度有关。电子云密度降低,

去屏蔽作用增强,向低场位移, 增大。

1)诱导效应

2)共轭效应

3)磁各向异性效应

4)氢键缔合

5)范德华效应


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第五节 结构研究法(Methods of Structure identification)

4. 核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance NMR)

4.1 氢谱(1H-NMR)

④.偶合常数(J)

a.偶合裂分是有原子核引起的,通过化学键传递;

b.相互偶合的H核其J值相同;

c.一级图谱峰的裂分遵循n+1规律;

d.归属H核,判断排列情况.

  • 偶合分类

    偕偶(Jgem)又为同碳偶合

    sp3 J=10-15Hz;

    sp2 C=CH2 J=0-2Hz,

    N=CH2 J=7.6-17Hz


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第五节 结构研究法(Methods of Structure identification)

偶合分类

邻偶(Jvic)

饱和型: 自由旋转J=7Hz

构象固定: 0-18Hz,与两面角有关,J90=0Hz, J180 >Jo

(7.5Hz);

烯型:Jcis =6-14Hz(10), Jtrans=11-18Hz(15)

芳环: Jo=6-9Hz,.

远程偶合:

如烯丙偶合 J4=0-3Hz,苯环的间位Jm=1-3Hz和对位偶合Jp=0-1Hz


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第五节 结构研究法(Methods of Structure identification)

4. 核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance NMR)

4.2 碳谱(13C-NMR)

①为结构解析提供的信息

化学位移:碳处的化学环境

峰高或峰面积:一般不与碳数成正比


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第五节 结构研究法(Methods of Structure identification)

4. 核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance NMR)

4.2 碳谱(13C-NMR)

②常见一些基团的化学位移值:

脂肪C: <50

连杂原子C: C-O,C-N,C-S :50-100

C-OCH3 :  55;

糖端基C :  95-105

芳香碳,烯碳: 98-160

连氧芳碳 :140-165

C=O: 168-220


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第五节 结构研究法

C=O: 168-220

醛CHO:  190-205

酮: 195-220

羧酸: 170-185

酯及内酯: 165-180

酰胺及内酰胺: 165-180


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第五节 结构研究法

4. 核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance NMR)

4.2 碳谱(13C-NMR)

a 全氢去偶谱(COM)或噪音去偶谱(PND)或质子宽带去偶谱(BBD)

特点: 图谱简化, 所有信号均呈单峰.

b 偏共振去偶谱(OFR)

特点: 由于部分保留1H的偶合影响,可识别伯、仲、叔、季碳。

CH3, q, CH2, t, CH, d, C, s。

常见的13C-NMR谱的类型及二维谱


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BBD


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第五节 结构研究法(Methods of Structure identification)

练习:

一化合物,分子式为C6H14,高度对称,在噪音去偶谱(COM)上只有两个信号,在偏共振去偶谱(OFR)上只有一个四重峰(q)及一个二重峰(d),试写出其结构


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第五节 结构研究法

4. 核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance NMR)

4.2 碳谱(13C-NMR)

③.常见的13C-NMR谱的类型及二维谱

c. DEPT谱

  • 特点:不同类型13C信号呈单峰分别朝上或向下,可识别CH3,CH2,CH,C.

  • 脉冲宽度 =135°CH3, CH , CH2(常用)

    =90°CH ,

    =45°CH3, CH2 , CH , 季碳不出现


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DEPT谱

135º =135°CH3, CH , CH2

90º

CH 


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第五节 结构研究法

③.常见的13C-NMR谱的类型及二维谱

  • 1H-1H COSY(相互偶合的氢核给出交叉峰)

  • NOESY(空间相近的氢核的关系)

  • HMQC(13C-1H COSY) 13C,1H 直接相关谱1JCH

  • HMBC(远程13C-1H COSY) 13C,1H 远程相关谱 2JCH, 3JCH


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HMBC


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第五节 结构研究法

练习:

一天然产物A为淡黄色针状结晶,紫外灯下(254nm)呈暗斑, FeCl3显兰色.

1H-NMR (CDCl3, TMS):  9.83(1H,s), 7.43(1H, dd, J =8.5, 1.5Hz), 7.26(1H, d, J =1.5Hz), 7.04(1H, d, J = 8.5Hz), 3.97(3H, s, OCH3)

13C-NMR (CDCl3): 190.9, 151.6, 147.1, 129.9, 127.6, 114.3, 108.7, 56.1.

HREI-MS示分子式为C8H8O3.

推测结构。


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第五节 结构研究法

答案:


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第五节 结构研究法(Methods of Structure identification)

5. 旋光谱和圆二色散光谱(ORD and CD)

(Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichroism)

旋光谱(ORD)和圆二色谱(CD,需对紫外可见光有吸收)在解决手性中心附近有生色团(含通过化学转换可变成生色团的化合物,如-OH、C=O)的化合物的绝对构型或优势构象的。

当平面偏振光通过手性中心时,左旋圆偏光和右旋圆偏光的折射率、传播速度,当再合成平面偏振光时,偏振面就发生了旋转,这就是产生旋光的光学原理。随着波长变短,折射率差值增大,比旋度增大。


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第五节 结构研究法(Methods of Structure identification)

在不同波长下测定物质的比旋度,以比旋度为纵坐标,波长为横坐标做图,该图称为ORD谱。

ORD谱的分类

(1). 平坦谱线

无峰无谷,有旋光性,但手性中

心附近无生色团。

正平坦曲线: 随波长短移比旋度增大

负平坦曲线: 随波长短移比旋度减小


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第五节 结构研究法(Methods of Structure identification)

(2). 单纯Cotton曲线

有峰有谷,手性中心附近有生色团。

正Cotton曲线: 长波 短波,先峰后谷

负Cotton曲线: 长波 短波,先谷后峰

(3). 复合Cotton曲线

有几个峰和几个谷。


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第五节 结构研究法(Methods of Structure identification)

结构与ORD谱的关系

结构与ORD的关系已总结了许多规律,现只介绍应用最广泛也是最古老的一个规律八区律(octant rule)。

(1). 平面分割法

用三个相互垂直的平面a、b、c分割成八个区域,以c平面为界,平面前称“前区”,

平面后称“后区”。 每个区又可分为上下左右四个分区,各区旋光分担如图所示。


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(2).投影法

环己酮各原子主要落在c平面“后区”,为判断旋光分担方便起见采用投影法。

a). C4的a和e,C2和C6的e键取代基均无贡献。

b). C5的a和e,C2的a键取代基均为正贡献。

c). C3的a和e,C6的a键取代基均为负贡献。

d). 旋光贡献具有加和性。

e). 距离羰基越远,贡献越小。

f). 集团越大,贡献越大。

(+)

(-)

a a


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ORD谱的应用

(1). 优势构象的确定

经测定右旋异薄荷酮为负Cotton曲线,请根据ORD谱确定优势构象。

(5)-(4)-(3)

(6)-(1)-(2)

负Cotton曲线

(5)-(4)-(3)

(6)-(1)-(2)

正Cotton曲线

平面 椅式 八区律要求的椅式

异丙基a为键,甲基e为键


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(2). 绝对构型的确定

某化合物为3-OH, 3-十九烷基环己酮,经测定ORD为正Cotton曲线,请根据ORD谱确定绝对构型。

a). 先写出R构型和S构型的结构式。

b). 写出优势构象式(十九烷基为大集团应在e键上)。

c). 转换成八区律要求的椅式构象式或投影式。

d). 根据八区律确定绝对构型。

负Cotton曲线

R型

正Cotton曲线

S型

故该化合物为S构型


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CD谱简介

当分子中具有生色团时,手性分子对左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的吸收是不同的,即L = R。当再合成平面偏振光时就变成椭圆的。以或摩尔椭圆度[]为纵坐标,以波长为横坐标做图就得圆二色谱。

[] = 3300 

圆二色谱也有正Cotton效应曲线和负Cotton效应曲线,峰形向下的为负,峰形向上的为正。


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圆二色谱与旋光谱的关系


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(1).一个复杂的化合物,并不一定其所有的吸收峰都呈现光学活性负担(如III带)。

(2).CD谱能很明确的表现出吸收带的圆二色性(如I带和II带)。

(3). 由于旋光性的叠加ORD不如CD谱明确。


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The End


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