实验三
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实验三. RT-PCR. 实验原理. 逆转录 理论依据:真核生物结构基因有 内含子 基因在 转录水平 的表达是不同的 实验原理:以 mRNA 为模版,逆转录获得 cDNA 。 PCR 理论依据:半保留复制原理 DNA 双链碱基互补 在不同温度下变性与复性 实验原理:以 cDNA 为模版经复制以几何级数扩增同一序列,获得大量相同 DNA 序列. 逆转录原理. 理论依据 真核生物基因多为 断裂基因 ,编码区不连续,需经转录后加工,才能成为成熟 mRNA 。

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Presentation Transcript


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实验三

RT-PCR


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实验原理

  • 逆转录

  • 理论依据:真核生物结构基因有内含子

    基因在转录水平的表达是不同的

  • 实验原理:以mRNA为模版,逆转录获得cDNA。

  • PCR

  • 理论依据:半保留复制原理

    DNA双链碱基互补

    在不同温度下变性与复性

  • 实验原理:以cDNA为模版经复制以几何级数扩增同一序列,获得大量相同DNA序列


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逆转录原理

  • 理论依据

  • 真核生物基因多为断裂基因,编码区不连续,需经转录后加工,才能成为成熟mRNA。

  • 以真核成熟mRNA为模板合成cDNA,则获得有连续氨基酸编码的DNA序列,无需转录后加工,可在原核细胞中表达。

  • 基因转录水平与分化、调节、疾病等相关


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内含子

外显子


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AAAAAAAAA- 3’

逆转录酶

AAAAAAAAA- 3’

  • 实验原理

  • 以mRNA为模板、根据polyA尾设计的Oligo(dT)为引物,在逆转录酶催化下合成cDNA。

agTTTTT- 5’

agTTTTT- 5’


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PCR原理

  • 理论依据

  • DNA双链在体内外均可解链,分别作为模版指导子链的合成。

  • DNA双链碱基互补,以氢键相连

  • 随着温度的升高, DNA双链间的氢键断裂,DNA变性成单链。随着温度缓慢降低,双链重新形成,DNA复性。


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  • 实验原理:

    94—95℃

  • DNA模板(双链) 变性解链(单链)

  • 单链DNA模板与引物退火

    两段引物分别与待扩增靶DNA两端互补决定了扩增产物的大小和特异性。

    引物量>模板量 故引物与模板的退火远大于

    引物短,不易缠绕 模板双链自身的退火

  • 引物3’-OH在DNA聚合酶作用下沿单链模板延伸

    模板方向 3’→ 5’

    延伸方向 5’→ 3’


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催化酶

  • 逆转录酶

  • 天然逆转录酶具有逆转录、RNase H 及DNA聚合酶活性。为避免RNase H对反应体系中模板RNA的破坏,多被缺失。

  • 逆转录酶有禽源与鼠源两种。禽源逆转录酶的最适反应温度高于鼠源,有利于克服RNA的二级结构,因此反应效率更高。

  • 耐热DNA聚合酶

  • 嗜热水生菌中获得的Taq酶,缺乏校读活性,突变频率千分之一,适合检测基因转录水平。

  • 具有校正活性的耐热DNA聚合酶(高保真DNA聚合酶),适合扩增需克隆的基因。


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引物

  • 逆转录引物

  • Olig(dT)可与mRNA的polyA互补,特别在其3’端添加两个随机核苷酸的锚定引物,在引导合成cDNA时效率很高。

  • 随机引物对RNA种类没有选择性,特异性低。且随机引物与mRNA结合部位不固定,因此不适宜全长cDNA合成。只有当mRNA缺乏polyA或RNA模板完整性较差时,选用随机引物合成cDNA 。

  • PCR引物

  • 引物决定退火温度

    退火温度=A/T数目×2+G/C数目×4

  • 两条引物总浓度应为1pmol/μl左右


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操作步骤

  • 逆转录

  • PCR


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(一) 逆转录

  • 取消毒的0.5ml离心管,加入下列成分:

    总RNA 1-5μg

    (根据浓度计算RNA模板要用量)

    Oligo(dT)引物 1μl

    dNTP Mix (10mM) 1μl

    加入无RNA酶的ddH2O至总体积15μl,混匀。

  • 置65℃保温5分钟,放于冰上。再加入下列成分:

    5×first-Strand Buffer 4μl

    MMLV(逆转录酶) 1μl

  • 混匀,42℃保温1~1.5小时。70℃保温15分钟。


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逆转录步骤说明

  • 65℃条件下,RNA二级结构被破坏。变性后置于冰上迅速冷却,可防止RNA二级结构的再形成,有利于RNA模板与引物的结合。

  • 70℃可导致逆转录酶变性失活,防止其对后续反应的干扰。同时也可分离cDNA第一链与模板mRNA。


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(二) 特定基因的PCR扩增

  • 取消毒的0.5ml微量离心管,加入下列成分:

    ddH2O 16.5 μl

    10×PCR Buffer 2.5 μl

    dNTP(2.5mM each) 2 μl

    逆转录产物 1 μl

    引物混合物(10μM each) 1 μl

    Taq DNA polymerase 1 μl

  • 混匀,加石蜡油1滴,离心4000转1分钟。

  • 热启动: 94℃变性3min

  • 扩增程序:94℃变性30sec,55℃复性30sec,72℃延伸1min,共反应35个循环。


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PCR步骤说明

  • 以GAPDH作为对照组扩增时应与实验组反应体系一致,只是引物不同。可先配制不含引物的双倍反应液,均分为两管,再分别加入引物。这样可保证两个反应体系的准确性。

  • 在94℃开始PCR反应称为热启动,可防止缓慢升温时发生非特异性扩增。标准的热启动是在反应体系置于94℃后再加酶,本操作方法更为简单。

  • 热启动耐热DNA聚合酶在94℃加热后才释放活性。

  • 不同的热循环仪升降温速度不同,对扩增程序的要求可能有所不同。一般加快升降温速度能缩短PCR反应的时间,但可能影响PCR反应的效率。


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电泳观察反应结果

  • 制备1.%琼脂糖凝胶

  • 取5μl PCR产物,加1μl加样缓冲液,混匀,上样。

  • 电泳,紫外灯下观察实验结果。

  • 可同时加入分子量标准品进行电泳,以鉴定PCR产物的长度。


Gapdh

GAPDH片断扩增电泳结果


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IL-1βIL-1IL-4IL-10IL-8

A B A B A B A B A B

18S

IL

电泳结果图示范(凝胶成像)


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