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质粒 DNA 的提取及检测. 质 粒 （ plasmid ）. 是染色体外小型（1-200 kb） 的 共价、闭合、环状的双链 DNA 分子（ cccDNA）， 能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（ 1 ~ n 个 ） 松弛型复制（ 20 个以上）. 常用的质粒载体. 是通过 DNA 重组技术构建而成的。 pUC18, pUC19(500 ~ 700.
E N D
质 粒（plasmid） • 是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 • 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 • 质粒的复制：严紧型复制（1~n个） 松弛型复制（20个以上）
常用的质粒载体 • 是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19(500~700
Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力
提纯的思路 • 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA • 要去除的物质： 蛋白 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA
质粒的检测——凝胶电泳 • 琼脂糖凝胶电泳 • 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
一、实验目的 • 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。
二、实验原理 • 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 • 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。
三、实验材料、器具及药品 • 实验材料 • 含PUCm-T的E. coli DH5α菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管), 离心管架。 • 实验器具 微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器。
实验药品 1.LB培养基配制及分装(每升用量) 胰蛋白胨(Bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(Bacto-yeast extract) 5g NaCl 10g pH 7.5 121℃，20min 高压灭菌
2.溶液 溶液Ⅰ 200ml 50mmol/L 葡萄糖 1.98g 25mmol/L Tris-Cl(pH 8.0) 5ml 1M 10mmol/L EDTA(pH 8.0) 5ml 0.4M 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH 2%SDS 临用前1:1混合贮存液即为II液. 溶液Ⅲ 5mol/L 醋酸钾 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml (最终pH4.8)
3.分离液 酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1 4.无水乙醇 5.70%乙醇 6.无菌水
各试剂的作用： • 溶液I 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 • 溶液II 作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 • 溶液III 作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA
平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。 • 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 • TE缓冲液：溶解DNA
四、实验步骤 接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜 取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀） 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 （可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀） 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min
12000rpm，离心15min 沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） 12000rpm，离心10min 沉淀超净台中风干 沉淀用20uL RTE溶解，-200C保存
相关知识 • 电泳：泳动速度决定于？ • 琼脂糖凝胶 天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。
核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 • 不同构型DNA的移动速度次序为： • 共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。
影响迁移率的因素 • DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压 一般5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。
常用染料 • EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。 • EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。 • EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 • SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样 品中，价格较昂贵。 • Gene finder:新型低毒，高灵敏度染料，加入样胶中，价格较低。
一、实验目的 • 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
二、实验原理 • DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 • 核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电； PH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 • 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 • 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。
三、仪器、材料与试剂 • （一） 仪器 • （二）材料 1.自已提取的质粒DNA 2.相对分子质量标准品 （三）试剂 1．5× TBE储液(PH8.0) 使用时稀释 10倍成0.5×TBE （1×TBE也可）。 2．凝胶加样缓冲液 0.2%溴酚蓝，50%蔗糖 3. 琼脂糖 4.10mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4℃保存。用时稀释成5ug/ml的EB。
四、实验操作步骤 • 琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大小来确定）. • 凝胶板的制备 • 加样（加样体积在10~30ul） • 电泳 • 染色 • 结果观察
五、实验结果与讨论 • 根据观察结果，绘图。 • 分析自提质粒的情况。
