第二部分
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第二部分 DNA 重组的载体 载体的三大功能: 1 )为 外源基因 提供进入 受体细胞的 转移能力。 2 )为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合能力。 PowerPoint PPT Presentation


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第二部分 DNA 重组的载体 载体的三大功能: 1 )为 外源基因 提供进入 受体细胞的 转移能力。 2 )为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合能力。 3 )为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。. 理想载体具备四个条件: 1 )具有 对受体细胞的 可转移性,提高导入细胞的效率。 2) 具有与特定受体细胞相适应的 复制位点 或整合位点, 使外源基因在受体细胞中 稳定遗传。 具有 多种单一的核酸内切酶识别 切割位点, 有利于 外 源基因的 拼接插入。 4 ) 具有合适的选择标记(报告基因),

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第二部分 DNA 重组的载体 载体的三大功能: 1 )为 外源基因 提供进入 受体细胞的 转移能力。 2 )为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合能力。

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Presentation Transcript


Dna 1 2

第二部分 DNA 重组的载体

载体的三大功能:

1)为 外源基因 提供进入 受体细胞的 转移能力。

2)为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合能力。

3)为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。


Dna 1 2

  • 理想载体具备四个条件:

  • 1)具有 对受体细胞的 可转移性,提高导入细胞的效率。

  • 2) 具有与特定受体细胞相适应的 复制位点 或整合位点,

  • 使外源基因在受体细胞中 稳定遗传。

  • 具有 多种单一的核酸内切酶识别 切割位点,

  • 有利于 外 源基因的 拼接插入。

  • 4 ) 具有合适的选择标记(报告基因),

  • 便于DNA重组分子的检测。


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一.质粒载体 (Plasmid)

1.质粒的基本特性

1)自主复制性。

具有自己的复制起始位点 (Origing)(ori) 和

控制复制频率的 控制基因 及编码基因,

形成 独立复制子 (Replico) 结构。


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2)可扩增性。

▲ 严紧型复制质粒 (Stringent)

由宿主细胞内聚合酶III介导,

为质粒上编码的蛋白因子正调控,蛋白因子极不稳定,

每个细胞复制1-5个质粒拷贝。

▲ 松弛型复制质粒 ( Relaxed)

质粒复制需要半衰期长的聚合酶I;聚合酶,

以及辅助的蛋白因子参与,合成减弱或完全中断时,

质粒复制持续进行,具有高拷贝数30-50个。


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▲ 当加入氯霉素抑制蛋白质生物合成,阻断宿主菌代谢途,

而松弛型复制质粒利用丰富原料及能量大量复制,

每个细胞积累上千个DNA分子。

这个过程依赖质粒上基因产物与蛋白因子相互作用。

3) 可转移性

在天然条件下,野生型质粒通过细菌接合作用

从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。


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4) 不相容性

相同 或 相似 复制子结构及特征的两种不同质粒

不能稳定地存在于同一受体细胞内,

这种现象称质粒的不相容性。

a) 两种不同质粒同时进入受体细胞,两者复制的起始频率随机.

b) 分裂前夕的拷贝数不均等,

经过若干次细胞分裂后必然导致, 两种不同质粒的独占性。

选择标记的插入失活


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插入失活


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2.质粒的改造与构建

1)删除不必要的DNA区域,缩小分子量,提高外源DNA片段

装载量。

2)灭活某些质粒的编码基因。

3)加入易于识别的选择标记基因。

4)选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列---

多克隆接头. (Polylinker)

5)加入特殊的基因表达调控元件。

载体的质粒构建过程 图3-1,图3-2


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金属硫蛋白突变体基因 α-α在蓝藻中克隆

一.简介

1.α-α 小鼠金属硫蛋白突变体 α结构域 二聚体α-α,

对重金 属有强结合能力。

2.PpSbA 强启动子,在叶绿体,大肠杆菌,蓝藻中强启动功能

3.pRL-αα 中间载体,突变体与强启动子相连.

4.PDC-αα 穿梭表达载体, 5.PCC7120 鱼星藻

目的: 构建穿梭表达载体,含有强启动子,

金属硫蛋白突变体基因,在蓝藻中表达。

表明: 转基因藻具有吸附金属的能力。


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穿梭表达载体的构建

1. 人工合成两引物,

5’-GA GAATT CATTCATGTGCTGCTCCTGCTGCTGT-3’

BamH l

5’-CT GGATC CTCAGGCACAGCAAGTGCAiGCA-3’

E.coR1

与 PG2A 进行 PCR,得到突变体基因,两端含有

E.coR 1 和 BamH 1 双酶切位点。


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  • 2. RL-439 中间质粒。被 E.COR I 和 BamH I 双酶切.

  • (1.2.)两者 T4-连接酶 连接,

  • α-α基因 定向克隆到 强动 子 PpSbA 之后.

  • 4. PpSbA强启动子,在叶绿体,大肠杆菌,蓝藻强启动功能

  • 5. 穿梭表达载体的获得

  • 1) 中间载体 PRI-αα, 穿梭表达载体 pDC-08 用EcoRI 酶切

  • 2) T4-DNasa 相连,

  • 3) 用 EcoRI 酶切载体, 鉴定。


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6. 三亲结合转移与筛选,

7. 转化子鉴定。

8. 蛋白质印迹鉴定.


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图1 愈伤组织小块接种于不同比例的激素中,待分化。


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图2 愈伤组织已长成。


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3.质粒的分类及用途

1)克隆质粒: 用于克隆和扩增外源基因。

2) 测序质粒:

a) 高拷贝复制,便于DNA片段克隆和扩增。

b) 含多酶切口的接头片段,在接头片段两端邻近区域,

设有两个不同的引物序列,重组质粒变性后即可测序。

3) 整合质粒:

含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列,克隆在整合

质粒上的外源基因进入受体细胞后,准确重组整合在

染色体 的特定位置上。


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4)穿梭质粒

a) 分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构及

相应选择标记基因,

因此能在两种不同种属的受体中复制并检测。

大肠杆菌---链酶素穿梭质粒,大肠杆菌---酵母菌穿梭质粒。

b) 克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载体

直接从一个受体菌转移至

另一个受体菌中复制并遗传。


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5)探针质粒

a) 设计用来筛选克隆基因的表达调控元件,

如启动子,终止子。

b) 装有定量检测表达程度的报告基因,

(抗生素的抗性基因)

c) 缺少启动子,终止子,载体本身不能表达报告基因

d) 当含有启动子,终止子的DNA片段插入合适的位点,

报告基因才能表达。

e) 表达量的大小直接反应

被克隆基因的表达调控元件的强弱。


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  • 6)表达质粒

  • a) 在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的

  • 启动 子,合适的核糖体结合位点(SD 序列),

  • 终止子结构。

  • 使得克隆在合适位点上的任何外源基因

  • 都可在受体细胞中,高效表达。

  • 大肠杆菌常用启动子:Lac, Tac, Trp,和来自噬菌体

  • 强启动子 PL, PR 。

  • 它们 由大肠杆菌 RNA 聚合酶 识别 起始.


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  • 来自 T7 噬菌体的 T7 启动子。

  • 必须由 T7 噬菌体来源 T7 RNA聚合酶 识别 起始转录。

  • d) 表达载体用 T7启动子必须用能产生 T7 RNA 聚合酶的

  • 受体菌株 JM109 , BL21(DE3)。

  • e) PSPORT 系列和 pSP 系列。


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4. 实验室常用大肠杆菌载体

质粒 大小(Kb) 选择标记 克隆位点 功能

pBR322 4.36 Ap,Tc BamHI,PstI,EcoRI 克隆载体

pGEX 4.9 Ap,Lac PstI,MluI, EcoRV 次级克隆载体

Ap,Iac, NarV 酶解作标准分子量

pKK233-2 4.6 Ap,Tc SalI, BamHI, 表达型NcoI位点提供

PstI, NcoI ,EcoRI 翻译启始密码子

pSP72 2.6 Ap XhoI, PstI, BamHI 表达型,携有

- HidIII EcoRV 双向T7,Sp6启动子

pSPORT1 4.11 Ap, Lacopz EcoRI ,SalI, Pst 表达型携有

BamHI ,HidIII 双向T7,Sp6启动子

pUC18/19 2.69 Ap,Lacz EcoRI, HidIII 测序载体,

KpnI ,BamHI 次级克隆载体


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质粒的纯化

1.碱裂解法

a) 溶菌酶 破细胞壁;

b) SDS-NaOH 混合液 去细胞膜,释放细胞内含物 ;

c) 高浓度 醋酸钾 沉淀染色体,去除染色体 DNA和 蛋白质;

d) 苯酚-氯仿灭活核酸酶,去除蛋白质;

e) 乙醇沉淀水相质粒;

f ) 用 Rnase 降解 RNA。

优点:质粒纯净 。 缺点:存在一定比例开环结构。

5.


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2. 沸水法

a)用牙签挑取固体培养基的菌体,

b)悬浮在 EDTA, Triton-100, 溶菌酶缓冲液 ,

c)沸水中 30-40s ,

d)离心,挑去沉淀物 ,

e)乙醇沉淀水相 质粒 DNA。

优点:速度快200个克隆/每天 , 缺点:纯度不高。

3. 由于空间结构不同,电泳条件下迁移率顺序:

cccDNA > L-DNA > OC-DNA > D-DNA > T-DNA

经限制性内切酶处理,所有结构都为直线性分子。


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电泳方向V

|T-DNA -------------

| D-DNA -------------

| OC-DNA -------------

V L-DNA ------------- -----------

Ccc-DNA -------------

对照 酶切

质粒 DNA 酶切图谱示意


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图 2-4 DNA 酶解后的电泳图谱

1 2 3 4 5 6 7


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3. 氯化铯密度梯度离心法 氯化铯— EtBr(溴化乙啶)

a) 细菌裂解及分离过程中染色体易断裂为线性分子

b)质粒DNA分子量小,结构紧密,保持环状。

c) 溴化乙啶插入 线性 DNA 多,密度低。

———— 石蜡油层

———— 蛋白质

———— 缺口环状和线性DNA

———— 闭环质粒DNA

———— RNA


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  • 二.入-双链 噬菌体

  • 入- 噬菌体生物学特性:

  • 是大肠杆菌温和型 噬菌体,

  • 由头部外壳蛋白和 48.5 kb 双链DNA 组成,

  • 入- DNA两端各有一个12 碱基 组成互补单链,称cos末端,cos 末端将 DNA 引入头部结构。

  • 大肠杆菌 宿主细胞裂解释放 噬菌体颗粒,

  • 噬菌体 颗粒又感染附近大肠杆菌,形成新一轮裂解周期,

  • 入- 噬菌体 悬浮液加到大 肠杆菌液体培养基,

  • 37C° 培养 6小时,培养液由 混浊变 澄清,

  • 说明大肠杆菌完全被裂解。


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  • 噬菌斑

  • A. 入- 噬菌体 悬浮液 加到 大肠杆菌,

  • 和琼脂糖 固体 培养基, 37C°过夜。

  • B. 固体平板培养基 出现 透明斑点(噬菌斑).

  • 噬菌斑是 经过若干裂解周期 形成 宿主菌死亡区域。

  • 同体培养基限制,透明圈外围大肠杆菌 仍能生长.

  • 一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒,

  • 均由一个噬菌体无性繁殖所产生的,

  • 是入- 噬菌体 DNA 用于分子克隆的基本原理。


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  • 三.入-双链 噬菌体 载体

  • 入-DNA 通过噬菌体特异性感染高效进入宿主细胞

  • 或受体 细胞,

  • b) 入-DNA在大肠杆菌中高拷贝复制,

  • c) 噬菌体的头部空壳蛋白对 入–DNA 的包装与其序列无关,只 识别COS位点。

  • d) 在分子克隆早期就被选作载体使用。


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1.重组体分子的体外包装

1)把带有目的基因的外源片段插入载体,

导入寄主细胞。直接感染大肠杆菌,

转染 (transfection) 形成 噬菌斑。

2)体外包装,把重组体分子包装为

成熟的噬菌体颗粒,

再导入寄主细胞。


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3)入-DNA 包装 入-噬菌体 头部前体结构

a) 头部空壳蛋白可包装最大限度 51 Kb,

大于 51 Kb 头部包装 不进去,

最小限度 38 Kb,

小于 38 Kb 噬菌体颗粒无侵染性。

包装限度是 入-DNA 总长的 75%-105% (38 Kb,—51 Kb)

b) 野生野生型 入–DNA 长度为 48 Kb,

其中 40%, 约20 Kb 对 整合,切割极其重要。

c) 野生型 入–DNA 基因组中

编码必要基因的 DNA 区段约 占20 Kb.

d) 带目的基因的外源片段 入–DNA 载体极限约 23 Kb.


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2.野生型 入–DNA 载体的构建

1) 缩短长度,提高外源 DNA 片段的 有效装载。

入–DNA 中部重组整合区占 入–DNA 的 40% ( 19.4 Kb),

缺失不影响 入–DNA 复制与裂解周期,可重组改造。

改造后带目的基因的外源片段 入–DNA 载体极限 23 Kb

2)删除重复的酶切位点。

a) 野生型 入–DNA 有重复酶切位点,5个EcoRI,7个HidIII.

b) 引入多酶切口接头。


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  • 3)灭活与裂解周期有关基因。

  • a) 野生型 入–DNA 经改造后在所有大肠杆菌内进行繁殖,

  • 极易扩散传播,重组体分子的性质,

  • 对生物体或人才类带来危害。

  • 将无义突变引入裂解周期有关基因内,

  • 这种 入–DNA在的少数 大肠杆菌菌株中繁殖(K12)

  • 大肠杆菌 K12 在蛋白质合成时 纠正无义突变。


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4)引入 选择标记 基因。

LacZ,(基因片段来自大肠杆菌)

a) 蓝色噬菌斑

入–DNA载体编码β -半乳糖苷酶N端前146个氨基酸与

大肠杆菌宿主 表达的 β -半乳糖苷酶 C 端 肽段互补

(α-互补)形成全酶,

酶将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D -半乳糖苷(X-gal)降解,

成为蓝色产物, 淡蓝色噬菌斑。

b) 无色噬菌斑

重组外源基因插入后将酶灭活,

重组噬菌体形成无色噬菌斑。


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CI+标记基因, 溶源状态,混浊噬菌斑—→透明(重组)。

CI+ 基因编码 CI 阻遏蛋白,

CI 基因突变的入-噬菌体形成透明 噬菌斑。

a. 入DNA 载体携带含有 EcoRI 切点的 CI+ 标记基因,

b. 这种载体进入高频溶源化突变的大肠杆菌内,建立溶源

状态,形成混浊噬菌斑,(溶源细胞比未感染的细胞生长慢)

c. 当外源基因插入到 CI+标记基因 EcoRI位点时,

导致CI+ 基 因灭活,重组噬菌体,因不能建立溶源状态而

形成 透明噬菌斑。


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  • Spi+ (P2干扰敏感性 ),

  • 1. 野生型 入– 噬菌体 在 P2 噬菌体溶源化的大肠杆菌中

  • 不能进入裂解周期,称干扰敏感性。(不形成噬菌斑)

  • 但缺失重组基因 red, gam 的入– 噬菌体 在P2 噬菌体溶源化 的大肠杆菌将不受影响,裂解溶源菌正常繁殖

  • 而形成噬菌斑。

  • 3. 外源重组基因插入与载体某一片段缺失同时发生缺失片段含有red, gam基因. (即red, gam基因缺失)

  • 凡是重组 入– 噬菌体 呈现 Spi –表型 即裂解溶源菌

  • 形成噬菌斑


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2.入–DNA 分类 及 用途

a) 插入型载体:

改造后 入–DNA 载体长度正好为包装下限,称插入型载体。

允许 外源DNA 插入片段 0-14.5Kb。

b) 取代型载体:

入–DNA 长度 40Kb,

在非必需区含两个相同酶切口,之间距离 14Kb,

去除这 14Kb 用外源DNA片段取而代之。

1) Charon 系列

设计克隆外源 DNA 大片段的 取代型载体


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2) EMBL 系列

设计克隆外源 DNA大片段 的 取代型载体。

优点:便于将外源DNA片段从重组体分子上切下。

3) 入-DASH 系列

含有 方向互为相反 的两套多 克隆位点接头序列,

优点: 便于多种 外源 DNA大片段的 取代重组。

4) 入-gt 系列

插入型表达 载体可用来克隆表达外源 c-DNA,

优点: 载体上温度敏感型阻遏物, 用来控制复制

及融合蛋白的表达。


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  • 3.入–DNA 的纯化

  • 含有 乳糖和 MgCI 的 LB 培养基上培养 大肠杆菌,

  • 至 对数生长期。

  • 2) 加入合适滴度 入-DNA 噬菌体悬浮液,

  • (已包装好含外源DNA),37℃ 1h。

  • 新鲜 LB 培养基 稀释培养物。培养 4-12 h ,

  • 噬菌体颗粒达1013 /L-1014 /L。

  • 4. 加入固体 NaCI 和 PEG -800,高速离心沉淀 噬菌体颗粒

  • 5 . 蛋白酶K 处理 噬菌体悬浮液,苯酚-氯仿 抽提,释放

  • 入–DNA。

  • 6. 乙醇沉淀DNA。


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  • 此法抽提 入–DNA 纯度不高,含染色体DNA,程序简单。

  • 第4)改用 CsCI 密度梯度离心, 获得高纯 入–DNA 样品。

  • 三. M13 单链 噬菌体 载体

  • 1.  单链 环状 性丝状 噬菌体,

  • 特异性感染 含性散毛结构的大肠杆菌。

  • 2. M13–DNA 所有基因都是 必需的,不能删除。


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  • 3. 通过 定点诱变,插入片段进行改造。

  • 1)通过定点诱变,封闭重复酶切切口。

  • 2)引入选择标记基因:启动子,操作子,β-半乳糖苷酶氨基

  • 端编码序列(LacZ )的操纵子片段(Lac )组氨酸(his ),抗生素抗性基因

  • 3)人工合成多克隆位点接头片段插入标记基因内部,含重组 子 噬菌斑呈白色,含载体 DNA 的 噬菌斑 呈蓝色。

  • 4)多克隆位点 接头片段两侧改为统一测序引物序列,

  • 分离 的重组分子的单链形式直接用于测序。


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四.噬菌体-质粒杂合载体

噬菌体特征区域与质粒重组,具有优良性能。

1.考斯质粒 (Cosmid)

1)入-DNA的 cos 区与质粒 DNA 重组,

2)入-DNA 装载量 23Kb ,

3)入-DNA 包装蛋白识别 cos 信号,与包装性质无关,

用质粒取代 入-DNA,大幅度提高外源DNA装载量。

4)入-DNA-cos 位点及附近区域 1.7 Kb 质粒 3.3Kb。

构成 考斯 质粒共 5Kb,

5)最大装载量 45.9 Kb(50.9-5 Kb)。


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2. 噬菌粒载体

丝状噬菌体 DNA 复制起始点序列与质粒 组成杂合子。

1)具有质粒基本性质,便于外源 DNA 克隆及筛选。

2)提高外源DNA装载量,一般载体分子小其装载量大。

3)M13—DNA 重组分子在复制时易发生 DNA 缺失,噬菌粒重组分子则相对稳定。

4)常使用的噬菌粒载体

pGEM-3Zf 3.2Kb pUC118/pUC119 3.2Kb

pZ258 4.9 Kb pEMBL 4.0 Kb


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五.动物病毒载体

1.特点:向 真核细胞 运载目的基因,

动物病毒是理想基因工程载 体。

1)整合性感染是病毒核酸整合到细胞染色体上,随复制而扩增。

2)序列中具有很强启动子,病毒感染细胞有大量拷贝高效表达

3)在感染细胞中提取病毒 比细菌中提取质粒更好。


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2 .杆状病毒载体( AcMNPV 裂解病毒)是昆虫表达系统。

1)杆状病毒表达体系用于真核细胞内蛋白质修饰,加工,转运.

2) AcMNPV 是非辅助性病毒。

3) 使产物呈溶解状态。

4) 基因很大(130Kb),克隆大片段的外源基因。

5) 不感染脊椎动物,启动子在哺乳动物细胞内无活性。

6) 用于毒性 蛋白质,癌基因表达,优越,可靠。

缺点:昆虫细胞培养周期长,技术较难掌握。


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3. 痘苗病毒载体

痘苗病毒 ( Poxvirus) 是动物病毒中最大一类 痘病毒。

载体三个成分:

1. 调控序列,

2. 可插入外源基因限制性内切酶位点,

3. 胸腺嘧啶核苷激酶基因(tK)

作用:

痘苗病毒是高效活疫苗,它的DNA作为载体插入一或

几种外源基因,构建多价疫苗株,

同时预防几种致病微生物引起传染病。


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3. 痘苗病毒载体

痘苗病毒 ( Poxvirus)

1) 基因组庞大,双链,线状,187 Kb,

2) 其中28 Kb区域病毒非必需区,可切除,取代外源基因。

3) 外源基因插入痘苗病毒中,重组痘苗病毒仍能正常复制。

4) 易于培养,高度稳定,在哺乳动物体内良好复制。

5) 应用痘苗病毒载体插入,表达外源基因,诱发抗体。

现已有:乙型肝炎表面抗原基因,流感病毒血凝素基因,

狂犬病毒表面糖蛋白基因,单纯疱疹病毒,EB病毒,

水疱性口炎病毒,伪狂犬病毒等有关基因。

牛痘苗病毒载体插入艾滋病基因,产生艾滋病抗体。


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4. SV40 病毒载体 (表达真核基因使用哺乳动物表达体系)

猴病毒40 (Simian virus 40)

共价,闭环,双链,长5.2 Kb, 5243个碱基对,

功能分为:早期转录,晚期转录。

1)早期转录,贯穿整个裂解循环,mRNA表达T抗原和t抗原。

T抗原对DNA复制,起始十分重要。t抗原,作用不清。

2)晚期转录, 发生DNA复制后,

表达 VP1, VP2, VP3是 病毒的 衣壳蛋白。

三个蛋白合成后与新复制病毒 DNA 装配成病毒颗粒,

病毒由细胞释出,细胞死亡。


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3)如向 SV40 插入外源基因,除去某些区段,

早期基因 被置换时不合成 T 抗原,

晚期基因被置换时不合成衣壳蛋白。

4)需要另外补充 cos 细胞,cos 细胞被转化的

猴传代细胞,在其染色体内的 SV40 DNA 能编码

T抗原,将重组基因导入 cos 细胞,可形成含有

重组基因的病毒颗粒。

5. RNA 病毒 载体

六.植物细胞 载体


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图1 烟草愈伤组织小块接种于不同比例的激素中,待分化。


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图2 烟草愈伤组织已长成。


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