克隆、转化相关知识
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克隆、转化相关知识. 基因工程的概念. 基因工程( genetic engineering )或重组体 DNA 技术 ( recombinant DNA technology) 是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中,并使之无性繁殖(称之为 “ 克隆 ” )和行使正常功能(称之为 “ 表达 ” ),从而创造生物新品种或物种的遗传学技术。. 基因工程基本步骤. ① 分离或合成基因 ②通过体外重组将基因插入载体 ③将重组 DNA 导入细胞 ④ 扩增克隆的基因 ⑤ 筛选重组体克隆 ⑥控制外源基因的表达 ⑦得到基因产物或转基因动物、转基因植物.

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Presentation Transcript

基因工程的概念

基因工程(genetic engineering)或重组体DNA技术( recombinant DNA technology)是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中,并使之无性繁殖(称之为“克隆”)和行使正常功能(称之为“表达”),从而创造生物新品种或物种的遗传学技术。


基因工程基本步骤

①分离或合成基因

②通过体外重组将基因插入载体

③将重组DNA导入细胞

④ 扩增克隆的基因

⑤ 筛选重组体克隆

⑥控制外源基因的表达

⑦得到基因产物或转基因动物、转基因植物


目的基因的来源

基因组DNA文库

cDNA文库

PCR 产物

人工合成


载体的基本结构及特点

具有能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点

具有多个限制性核酸内切酶的单一位点

具有易于筛选和检测的标记性基因

容易进入宿主细胞

容易从宿主细胞中分离纯化出来


Pbr322
大肠杆菌克隆载体pBR322物理图谱

Tetr


常用载体

质粒载体

噬菌体载体

粘粒载体

病毒载体

YAC载体


质粒载体的特点

具有较小的分子量

能独立自主复制

对宿主生存不是必需的


  • 严谨型:这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的,与寄主细胞的复制偶联同步。所以,往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝;

  • 松驰型:这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的,每个细胞中含有10-200份拷贝,如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒,要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。


质粒的构型

共价闭合环形DNA(cccDNA)

线形 DNA (lDNA)

开环DNA(ocDNA)


M1 1 2 M2

  • M1 DL2000Marker

  • Plasmid

  • Plasmid单酶切后

  • M2 λ-Hind III Marker



COS载体


YAC 载体


BAC 载体


PAC载体



载体与外源DNA的连接

DNA的连接主要根据外源片段的末端性质、

质粒性质以及两者的酶切位点来确定。

  • 粘性末端连接法

    同一限制酶产生的粘末端

    不同限制酶产生的相同的粘末端

    同聚物加尾法

  • 平滑末端连接法


EcoR I GAATTC

CTTAAG

5’----G AATTC----3’

3’----CTTAA G----5’

粘性末端


Sma I CCCGGG

GGGCCC

5’----CCC GGG----3’

3’----GGG CCC----5’

平端


载体的去磷酸化反应

粘性末端

单酶切

载体5’去磷酸化

双向插入

平端

粘性末端

单向插入

不需要去磷酸化

双酶切

平端

双向插入

去5’磷酸化


碱性磷酸酶:5’-(P)ATTGTCGATCCG-3’


基因序列导入细胞的方法

  • 转化(transformation):

    由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化

  • 感染(infection) :

    噬菌体进入宿主细菌,病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染。

  • 转染(transfection) :

    重组的噬菌体DNA进入感受态细菌进行复制和繁殖,这种方式称为转染。


转化的方法

  • 化学的方法(热击法);使用化学试剂(如CaCl2)制备的感受态细胞,通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞;

    2. 电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。


目的基因序列克隆的筛选与鉴定

  • 根据重组载体的标志作筛选

  • 核酸杂交法

  • PCR法

  • 免疫学方法

  • DNA限制性内切酶图谱分析

  • 核苷酸序列测定


根据重组载体的标志作筛选

  • 抗生素筛选:抗性基因插入失活

  • -互补


抗性基因插入失活

pBR322载体中有两个标记基因,一个是氨苄青霉素抗性基因(Ampr),另一个是四环素抗性基因(Tetr)。当一个外源基因片段插入这两个位点中的任何一个位点时,该抗性基因就会失去活性

Tetr


β-gal (ω) frag.

lacZ(α)

pUC19

β-gal (α) frag.

amp

Blue

-互补

JM109 ←pUC19

lacZ⊿M15

F '

lacIq

lac represser 過剰生産

β-gal (α+ω) frag.

IPTG

X-gal


应用举例

PCR产物(LA Taq体系)克隆到T载体

一、连接

载体与插入片断的比例:

载体量(ng) × 连接片段长度(kb)

× (3~10)

连接片段量(ng) =

载体长度(kb)

  • Insert fragment

  • T-vector 50ng

  • Solution Ⅰ 5 ul

  •   16℃ ,1h(若充分可过夜连接)

5ul


转化(热转化)

热转步骤如下:

(1)从-80℃中取出感受态细胞(JM109)置于冰上融化。

(2 ) 用移液枪去除100ml感受态细胞加入到上述连接液中,

混 匀,在冰上放置30分钟。

(3)取出后迅速置于42℃水浴中热激1分钟。

(4)立即放在冰上2-5分钟。

(5)加入900ml SOC培养基。

(6)混匀后移入转化管,在37℃恒温摇床上摇1小时。

(7)梯度涂在带有抗性的平板上。

(8)平板放入37℃恒温箱中过夜培养。


筛 选

1.蓝白筛选

2.PCR筛选(应用T-vector上的引物RV-M / M13-47)

3.挑选已插入正确片断的菌落植菌

4. 37℃ O/N培养



ぁりがとぅ

ござぃます!


从基因文库中调取目的基因

基因文库

cDNA文库

来源于细胞表达出的RNA,反映基因组表达的基因序列信息。

既有种属特异性,又有组织特异性。

基因组DNA文库

来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息。

只有种属特异性,而无组织特异性。


PCR

模板

适合用于已知序列基因片段的获得


人工合成法

利用DNA合成仪合成所需要的片段。适用于较小的已知序列基因片段的获得。


PCR筛选

M 1 2 3 4 5 6 7 8


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