1 / 55

Molekulární genetika rostlin

Molekulární genetika rostlin. Rostlinný genom Chromatin a metylace DNA RNA interference Mimojaderné genetické elementy Transpozóny, viry a viroidy Klasické genetické mapování Transgenoze a reverzní genetika Genomika Transkriptomika a proteomika. Členění rostlinného genomu.

vin
Download Presentation

Molekulární genetika rostlin

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Molekulární genetika rostlin • Rostlinný genom • Chromatin a metylace DNA • RNA interference • Mimojaderné genetické elementy • Transpozóny, viry a viroidy • Klasické genetické mapování • Transgenoze a reverzní genetika • Genomika • Transkriptomika a proteomika

  2. Členění rostlinného genomu • jaderný genom = genom sensu stricto • plastidy - plastom • mitochondrie - chondriom

  3. Velikost rostlinného genomu 54 Mbp – Cardamine amara 124852 Mbp - Fritillaria 149 000 Mbp - Paris japonica • momentálně největší • známý genom (nejen rostlinný) http://data.kew.org/cvalues/

  4. Velikost rostlinného genomu 10 Mb Ostreococcus (jednobuněčná řasa) 54 Mb Cardamine amara 64 Mb Genlisea aurea 125 Mb Arabidopsis 500 Mb Oryza 5 000 Mb Hordeum 17 000 MbTriticum 84 000 Mb Fritillaria (největší diploidní) 143 000 Mb Paris (oktaploidní) - u krytosemenných rostlin rozdíly ve velikosti téměř 3 000 x - u nahosemenných genomy často kolem 10 000 Mb - rozdíly v počtu genů menší (cca 20 – 200 tis.?) poměr objemu koulí 3000x

  5. Velikosti rostlinného genomu Co lze vyčíst? • - genomy v evoluci • rostou • průměrný nárůst • je vyšší u jednoděložných

  6. C-value paradox- neexistuje korelace mezi komplexitou organismu a velikostí jeho genomu • C-value = velikost nereplikovaného genomu v gametě • i genomy fylogeneticky blízkých organismů se často výrazně liší velikostí genomu: - duplikace úseků rostlinné DNA či celých genomů (polyploidizace) - množení invazní DNA - ale i redukce velikosti rekombinací a delecemi (2n bavlníky)! genome size (bp) = (0.910 x 109) x DNA content (pg) DNA content (pg) = genome size (bp) / (0.910 x 109) 1 pg = cca 910 Mbp; MW (1 bp) = cca 660 Da

  7. Typy sekvencí v jaderném genomu • Jedinečné sekvence – geny i nekódující • Středně repetitivní DNA • Tandemové repetice rRNA, tRNA a histonových genů (jejichž produkty jsou potřeba ve větším množství) • Mnohočetné genové rodiny • Pohyblivé genetické elementy (transpozóny) - i vysoké počty repetic (někdy spadají pod vysoce repetitivní) • Sekvence s nízkou komplexitou (vysoce repetitivní) • Tandemově uspořádané krátké sekvence (SSR) • Centromery (180 bp repeat Arabidopsis)a telomery (TTTAGGG)n - mohou se chovat jako satelitní DNA (micro-, mini-)

  8. repetitivnost/unikátnost záleží na velikosti posuzovaného „okna“ • (= velikosti analyzovaných fragmentů DNA) odbočka: sekvenční komplexita(~ množství nesené informace) repetitivní AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA komplexita 1 (21xA) ATCATCATCATCATCATCATC komplexita 3 (7xATC) (množství informace u kódující sekvence?) unikátní ATCGTATCGCGATTTTAACGT komplexita 21 (1xAT…)

  9. vysoce repetitivní sekvence středně repetitivní sekvence jedinečné sekvence Sekvenční komplexita Sekvenční komplexita rostlinných genomů

  10. Ukázka zastoupení repetitivní DNA u soji a silenky (klastry sekvenčně příbuzných repetic) Silene latifolia Gypsy, copia = rodiny retrotranspozónů clDNA = chloroplastová DNA (kontaminace jen částečně)

  11. Reasociační kinetika - měření komplexity genomu= analýzy genomů nejen v předsekvenační době • DNA fragmentována na 300 - 500 bp fragmenty a denaturována • průběh reasociace sledován v čase (chromatografické oddělení ss a ds DNA) • analýzou kinetiky (Cot křivek) lze zjistit podíl jedinečných a opakovaných sekvencí: princip: vzácné sekvence reasociují pomaleji než hojné

  12. Reasociačníkinetika- vliv komplexity DNA

  13. Eukaryotické genomy zpravidla obsahují tři frakce sekvencí lišící se komplexitou vysoce repetitivní = nízká komplexita středně repetitivní unikátní sekvence = vysoká komplexita

  14. Reasociačníkinetika malých a velkých genomů jedinečné sekvence středně repetitivní sekvence vysoce repetitivní sekvence (Westhoff: Molecular plant development, 1998)

  15. Rozdíly v uspořádání velkých a malých genomů velké genomy: geny přítomné v „gene-rich“ ostrovech mezi dlouhými úseky nekódující, zpravidla repetitivní DNA

  16. Rekonstrukce postupné kumulace mobilních elementů v genomu kukuřice Ve sledovaném úseku u prosa žádné transpozóny (TE), u kukuřice tvoří 60 % délky

  17. Repetitivní sekvence lze detekovat in situ (FISH) 180 bp A.th. copia A.th. 45S rDNA Crocus tandem repeats dp5a1 pšenice (Heslop-Harrison, Plant Cell 12:617, 2000)

  18. telomer. rep. žita (TTTAGGG)n celk. DNA pšenice žitné chrom. rameno v pšenici subtelomer. rep. žita (Heslop-Harrison, Plant Cell 12:617, 2000) interfázní jádro

  19. Sekvenování rostlinných genomů http://genomevolution.org/wiki/index.php/Sequenced_plant_genomes Stav k 4/13 – (šedivě méně kompletní genomy)

  20. Sekvenování velkých genomů • sekvenování po částech (chromozómech) • sekvenování nemetylované DNA • (= transkripčně aktivní) • sekvenování ESTs

  21. odbočka – definice pojmů: • Expressed Sequence Tags (ESTs) • - krátké sekvenované úseky cDNA(300-600 nt) • - zpravidla úseky genů (primárně z mRNA) • alternativní zdroj kódujících sekvencí u velkých genomů • (rychlé a levné) • - velmi redundantní, ale současně neúplné • problémy: - různé hladiny transkriptů • - genová exprese regulována orgánově, časově, vývojově, environmentálně, … • - chybí regulační sekvence (promotory, introny,...)

  22. Příprava EST knihovny • - mRNA • - RT s oligoT primerem – cDNA • - Štěpení heteroduplexu RNázouH • - Syntéza 2. vlákna cDNA • Štěpení restriktázou • - Ligace adaptorů klonování sekvenace

  23. Odbočka: životní cyklus modelové rostliny Arabidopsis thaliana 1 týden 3 týdny 4 týdny 6 týdnů

  24. geny geny geny geny geny ESTs ESTs ESTs ESTs ESTs TE = transposible elements TE TE TE TE Genom Arabidopsis: 125 Mbp vysoká hustota nízká hustota

  25. Predikce počtu genů v genomu

  26. Value Feature Chr.1 Chr.2 Chr.3 Chr.4 Chr.5 SUM DNA molecule Length (bp) Top arm (bp) Bottom arm (bp) Base composition (%GC) Overall Coding Non-coding Number of genes Gene density (kb per gene ) Average gene Length (bp) Average peptide Length (bp) Exons Number Total length (bp) Average per gene Average size (bp) Number of genes With ESTs (%) Number of ESTs 29,105,111 14,449,213 14,655,898 19,646,945 3,607,091 16,039,854 23,172,617 13,590,268 9,582,349 17,549,867 3,052,108 14,497,759 25,53,409 11,132,192 14,803,217 115,409,949 33.4 44.0 32.4 35.5 44.0 32.9 35.4 44.3 33.0 35.5 44.1 32.8 34.5 44.1 32.5 6,543 4.0 2,078 446 4,036 4.9 1,949 421 5,220 4.5 1,925 424 3,825 4.6 2,138 448 5,874 4.4 1,974 429 25,498 27,206 protein cod. + MIR, … 35,482 8,772,559 5.4 247 19,631 5,100,288 4.9 259 26,570 6,654,507 5.1 250 20,073 5,150,883 5.2 256 31,226 7,571,013 5.3 242 132,982 33,249,250 105,773 60.8 30,522 56.9 14,989 59.8 20,732 61.4 16,605 61.4 22,885 Genom Arabidopsis - statistika

  27. Většina rostlinných genů tvoří genové rodiny Počet členů rodiny (paralogů) • genové rodiny jsou často tandemově uspořádané, ale i rozptýlené po genomu • duplikoványjsou celé úseky chromozómů Arabidopsis (odráží dávné duplikace) • tandemové repetice z blízkých i vzdálených paralogů (nelegitimní rekombinace)

  28. Gene A” Species A Ancestral Species Gene A Gene A’ Species B Homologie - orthology vs. paralogy Orthologní geny = geny u různých organismů, které jsou přímými potomky genu přítomného u společného předka těchto organismů Paralogní geny = geny, které se duplikovali u daného druhu Gene A” Gene A’” Species A Ancestral Species Paralogous genes Gene A Gene A’ Species B

  29. Mechanismy zmnožení genů • (zvýšení počtu paralogů) • tandemové duplikace • transpozice • segmentální duplikace • celogenomové duplikace

  30. Jak se liší geny v genomech různých druhů? Geny Genové rodiny Arabidopsis x Populus – značný překryv (cca 1,5 x více paralogů u topolu) (Arabidopsis + Populus) x Oryza – mnoho genů specifických pro jednoděložné

  31. Arabidopsis je dávný polyploid(jako zřejmě většina rostlin) Duplikované úseky chromosómů tvoří 60 % genomu (67.9 Mb) Polyploidizace výrazně zvyšuje plasticitu genomu a zřejmě hrála významnou roli v evoluci rostlin (i rostlinných genomů) 30-80% druhů polyploidních, zodpovědné za 2-4 % nových druhů

  32. Polyploidizace v evoluci krytosemenných rostlin Fawcett et al. 2009

  33. Datování celogenomových duplikací dle počtu synonymních mutací na synonymní místo - Ks Phe Leu Met Val Ks=3/2,66 UUU CUA AUG GUU UUC UUG AUG GUU 0 01/3 1/3 01000 001 Počet genů Porovnání dvojic paralogních genů Peaky indikují celogenomové duplikace Ks Fawcet et al. 2013

  34. Polyploidizace v evoluci rostlin • 35 % druhů neopolyploidních • aneuploidní varianty (po allopolyploidizaci časté – pšenice - hexaploid) • stabilní linie pšenice s chybějícím raménkem (homeologníchchr.) • většina rostlin opakovaně v evoluci polyploidních: modré kolečko – zdvojení, hvězdička – ztrojení K-T (Fawcettetal. 2013)

  35. Zmnožení chromozomálních sad - polyploidizace n = x = 4 n = x = 4 n = x = 4 n = x = 7 x x spontánní zdvojení (endoreduplikace) (alt. splynutím neredukovaných gamet) 2n = 4x = 16 2n = 4x = 22 autopolyploidie allopolyploidie Podobná frekvence obou typů u polyploidních rostlinných druhů

  36. Zdvojení chromozómů je nutné pro meiózu(nejsou-li druhy blízce příbuzné se stejným počtem chromozómů) species A X species B sterile Genome duplication fertile Přednostní párování homologních chromozómů Mohou párovat i homeologní – příbuzné, ale pocházející od různých rodičů

  37. BBCC Příklad allopolyploidních genomůBrassica sp. BB Brassica nigra AABB Brassica juncea Brassica carinata CC AACC AA Brassica rapa Brassica olarecea Brassica napus

  38. Allopolyploidní tabáky – změny v obsahu DNA

  39. Osudy zmnožených genů se liší – teorie genové rovnováhy (gene dosage balance) • geny jejichž produkty přímo interagují (signální dráhy, podjednotky komplexů,.. tzv. „connected genes“) se snáze udrží po celogenomových duplikacích • - ztráta či dílčí zmnožení jedné z komponent vyvolá genovou nerovnováhu, která snižuje fitness, • - celý zmnožený komplex pak může být funkčně specializován a zvyšovat komplexitu organismu • - sekundární funkce zřejmě již přítomna u předka, duplikace umožní adaptivní evoluci obou funkcí bez selekčních zábran (nutnosti zachování primární funkce) - Escape from adaptive conflict - EAC model • u ostatních (např. metabolických) genů je tomu naopak – tyto geny se snáze ztratí po celogenomových duplikacích a lépe se udrží po dílčím zmnožení

  40. po celogenomové duplikaci se postupně velká část duplikovaných genů ztrácí (viz teorie genové rovnováhy) • ztráta často nebývá takto (↑) rovnoměrná na obou kopiích • zřejmě často epigenetické označení jedné z kopií (metylace - řepka) • přednostní ztráty genů a mutageneze u metylované kopie • ale někdy probíhá i genová konverze a homogenizace (!) • de novo kříženci (~ řepka olejka) – přestavby přednostně v homeologních úsecích chromozómů, ale bez preference rodičovského genomu • (= homologní, v jednom genomu, ale původem od různých rodičů)

  41. Události bezprostředně po vzniku allopolyploida: • změny v metylaci DNA • ztráty částí či celých chromozómů (aneuploidie – problémy s fertilitou) • často dochází k aktivaci TE • exprese homeologních genů zpravidla není v hybridu aditivní • - redukce může být asymetrická (vzhledem k rodičům) • - transkriptom bývá celkově redukován více než genom • orgánové rozrůznění exprese • (vzhledem k rodičovskému • původu) • nová místa exprese • nová regulace • - „divergent resolution“ - speciace • (odlišné ztráty duplikovaných genů u různých jedinců • - letalita v F2 generaci – může chybět esenciální • gen = reprodukční bariéra)

  42. Tvorba haploidních rostlin • přeprogramováním vývoje buněk samčího či samičího gametofytu in vitro– netvoří se gamety, ale dochází k procesu analogickému embryogenezi (ale ne ze zygoty) • - zpravidla z prašníkových kultur (nezralých mikrospor) = androgeneze • - možno i ze samičího gametofytu = gynogeneze • haploidní rostliny jsou sterilní • spontánně či kolchicinem lze navodit endoreduplikaci (replikaci bez mitózy) - vznikají dihaploidníkompletně homozygotní jedinci androgeneze (pylová embryogeneze) u řepky

  43. Počet chromozómů– význam? - jiné vazbové skupiny (možná výhoda?) (rekombinovatelnost genů) - omezení fertility hybridů, … • Velikosti chromozómů u rostlin 2,4 Mb Genlisea 30 Mb Arabidopsis 800 Mb Triticum

  44. Počet chromozómů(u některých druhů jsou navíc nepárové B chromozómy) • Počet chromozómů u rostlin - extrémy: • Haplopappus gracilis: 2n = 4 • Sedum suaveolens: 2n = cca 640 • Luzula sp. (bika): • 2n = 6 až 66 • holocentrické chromozómy • průměrná velikost chromozómu se mezi druhy liší až 60x L. pilosa L. elegans (Cullis, 2004)

  45. B chromozómy u rostlin • nepárové chromozómy u některých druhů (asi 1500, např. kukuřice) • nenesou zpravidla geny kódující proteiny • zpravidla negativně ovlivňují fitness rostliny (fertilitu) • - nejsou přítomny u všech jedinců v populaci • - parazitická DNA (?)

  46. Počet chromozómů a velikost genomu

  47. Genomy rostlin se podobají(i přes rozdílné počty chromozómů) Paterson et al., Plant Cell 12: 1523-1539, 2000

  48. A’ A’ Species A Species A B’ C’ B’ C’ A A Ancestral Species Ancestral Species B B C C A” C” B” B” Species B Species B C” A” Termín „syntenie“ se občas mylně užívá pro označení kolinearity Syntenie = přítomnost orthologních lokusů u dvou druhů na stejném chromozómu Kolinearita = skupina lokusů je u dvou druhů přítomna ve stejném pořadí

  49. Makro-kolinearita vs. mikro-kolinearita A’ A’ A Makro- i mikrokolinearita: In the 2 organisms being compared on the left, not only are the genes A, B, and C syntenic, but all the genes in between are as well. Zachována pouze makrokolinearita: In the 2 organisms being compared on the right, although genes A, B, and C appear syntenic, other genes in between are not. A t t k t u u n u B B v v B’ B’ g v w w o w x q x x C’ C’ C C • kolinearita (daná společným původem) se v průběhu evoluce postupně vytrácí

  50. Mikro-kolinearita v NOD lokusu mezi vzdálenými druhy bez zřejmé makro-kolinearity At – Arabidopsis, Pt – Populus, Lj – Lotus, Mt – Medicago, Os - Oryza

More Related