免疫细胞的分离与检测
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免疫细胞的分离与检测. 第一节 免疫细胞的分类与分离. 一、免疫细胞的种类与特征 二、免疫细胞的分离技术 三、细胞的冻存与复苏. 免疫细胞的特征. 1 、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性 2 、免疫细胞的膜分子特征 CD 分子. 免疫细胞的起源与分化. 红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T 细胞 NK 细胞. 免疫细胞的分离技术. 1 、密度梯度离心法 2 、黏附分离法 3 、荧光激活分离法 4 、磁性分离法 5 、其他分离法. 密度梯度离心法. 稀释抗凝血.

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免疫细胞的分离与检测

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Presentation Transcript


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免疫细胞的分离与检测


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第一节 免疫细胞的分类与分离

一、免疫细胞的种类与特征

二、免疫细胞的分离技术

三、细胞的冻存与复苏


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免疫细胞的特征

1、免疫细胞的形态学特征

理化性状

生物学特性

2、免疫细胞的膜分子特征

CD分子


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免疫细胞的起源与分化

红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞


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免疫细胞的分离技术

1、密度梯度离心法

2、黏附分离法

3、荧光激活分离法

4、磁性分离法

5、其他分离法


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密度梯度离心法

稀释抗凝血

血浆

单个核细胞

淋巴细胞分离液

粒细胞

红细胞

离心前

离心后


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2r2(Q—Q0)

x g

沉降速度 =

9  

Q =颗粒比重 Q0 =溶质比重 r =颗粒半径

 = 形状因子 = 颗粒摩擦系数/同体积球型颗粒摩擦系数

= 粘稠度 g = 相对离心力


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人类血液有形成分的平均密度与直径

密度 直径()

血小板 1.04—1.06

淋巴细胞 1.06—1.08 8—10

粒细胞 1.08—1.09 13

红细胞 1.09—1.10 7.5


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黏附分离法

尼龙毛法

贴壁法

亲和板法

吸附柱法


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样品

荧光检测器

流体护套

滤光片

透镜

喷嘴

接物镜

偏转板

激光束

细胞收集管

荧光激活分离法(FACS)


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流式细胞仪


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磁性分离法

磁铁吸引法

磁式细胞分类术法


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N

S

MACS (阳性选择法)


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N

S

MACS (阴性选择法)


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其他分离法

花环沉降法

细胞活化克隆法

MHC分子四聚体法


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T

抗原肽-MHC分子四聚体技术


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细胞的冻存与复苏

细胞冻存的原理与方法

细胞复苏的原理与方法


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细胞冻存罐


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第二节 免疫细胞膜分子的检测

一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型

二、免疫细胞膜分子的检测方法


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免疫细胞膜分子检测的原理与类型

1、以抗体识别抗原

2、以配体识别受体


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免疫细胞膜分子的主要检测方法

1、免疫标记检测方法

荧光抗体法

酶免疫检测法

免疫金银染色法

2、补体依赖的细胞毒试验(CDC)

3、花环形成试验


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SmIg的荧光抗体检测法


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SmIg的酶免疫检测法


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补体

染料

补体依赖的细胞毒试验(CDC)


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E-花环

花环形成细胞

B细胞

绵羊红细胞

T细胞


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EA-花环


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EAC-花环


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第三节 免疫细胞功能测定

一、转化、增殖试验

二、细胞毒试验

三、抗体形成试验

四、细胞吞噬与杀伤试验


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转化、增殖试验

1、淋巴细胞转化试验

2、混合淋巴细胞培养


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淋巴细胞转化试验原理示意

丝裂原(抗原)刺激

3H-TdR

放射性测定


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细胞毒检测试验

1、T细胞介导的细胞毒试验

2、NK活性测定

3、ADCC作用测定


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细胞毒试验原理示意

靶细胞

效应细胞

分离上清

放射性测定


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抗体形成试验

1、直接溶血空斑试验

2、间接溶血空斑试验

3、SPA-SRBC溶血空斑试验


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直接溶血空斑试验


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间接溶血空斑试验


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SPA-SRBC溶血空斑试验


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细胞吞噬与杀伤功能试验

1、细胞吞噬功能试验

2、细胞杀菌功能试验


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吞有颗粒的吞噬细胞数

吞噬百分率 =

计数的吞噬细胞数

吞噬细胞吞噬的总颗粒数

吞噬指数 =

计数的吞噬细胞数


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NBT还原试验

原理:

N-N-

C + H+

N=N-R-

N-NH2

C

N=NH

四氮唑基(淡黄色)

甲月簪基(紫黑色)


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NBT还原试验

方法:

1、抗凝血 + 硝基蓝四氮唑(NBT),37。C孵育25min。

2、推片染色、镜检。

正常值:

NBT阳性细胞 7.5-15%


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第四节 免疫细胞凋亡测定

一、细胞凋亡的概念与原理

二、细胞凋亡的检测方法


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细胞凋亡的概念与原理

1、细胞凋亡的概念

2、细胞凋亡的原理

3、细胞凋亡的特点


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细胞凋亡(apoptosis)

细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程,也称程序性死亡。


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细胞凋亡的过程

凋亡信号——凋亡受体——信号传导——凋亡基因启动——编码程序性死亡蛋白——细胞结构解体——细胞凋亡


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细胞凋亡机制


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细胞凋亡的特点

1、细胞皱缩

2、染色质边集

3、凋亡小体出现


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细胞凋亡


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细胞凋亡的检测方法

1、形态观察法

2、生化检测法

3、流式细胞仪检测法


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形态观察法

普通光镜检测——HE染色

甲基绿-派诺宁染色

荧光显微镜检测——溴化丙锭染色

透射电镜检测——典型形态改变


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生化检测法

凝胶电泳法

原位末端标记法

二苯胺分光光度法


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凝胶电泳法

原理:断裂DNA在凝胶中呈梯形排列

(DNA ladder)

方法:提取总DNA

DNA凝胶电泳

观察DNA ladder现象


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原位末端标记法(TUNEL)

原理:利用标记的dUTP,在TdT作用

下结合DNA断片的3’末端羟基,

显示断链DNA,提示凋亡

方法:制备组织切片

标记物结合

标记物显色

镜检


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二苯胺分光光度法

原理:细胞凋亡可产生低分子量DNA,通过超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离,分别测定两种DNA,即可得出凋亡百分率。

方法:裂解细胞

13000g超速离心

分别提取DNA

使DNA显色,测定


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上清液OD值

凋亡百分率 =

上清液OD值+沉淀OD值


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流式细胞仪法

原理:PI标记凋亡细胞,通过FACS可

显示凋亡细胞的特征性亚二倍体

峰。并可经计算分析得出凋亡百

分率。

方法:制备细胞悬液

PI染色

FACS检测


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本章小结

1、免疫细胞的类型与分离技术

2、细胞的冻存与复苏

3、免疫细胞膜分子的检测原理与方法

4、免疫细胞功能测定的原理与方法


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