1 / 13

Interferencja RNA (RNAi, RNA interference)

Interferencja RNA (RNAi, RNA interference). Nobel 2006 Andrew Fire i Craig C. Mello. RNAi historia 1998 – wprowadzenie dsRNA do nicienia C. elegans wycisza ekspresję genu o sekwencji komplementarnej → interferencja RNA (Craig, Mello )

valiant
Download Presentation

Interferencja RNA (RNAi, RNA interference)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Interferencja RNA (RNAi, RNA interference)

  2. Nobel 2006 Andrew Fire i Craig C. Mello

  3. RNAi historia • 1998 – wprowadzenie dsRNA do nicienia C. elegans wycisza ekspresję genu o sekwencji komplementarnej → interferencja RNA (Craig, Mello) • pierwsze wskazówki jednak już w latach 1990: próba wprowadzenia dodatkowego genu syntazychalonowej daje efekt odwrotny – poziom mRNA dla syntazy spada • Konserwatywny mechanizm w świecie zwierząt i roślin spełniający funkcje: • Obrona przed infekcjami wirusowymi • Obrona przed transpozonami • Regulacja metylacji DNA w obrębie promotora Matzke MA, Matzke AJM (2004) Planting the Seeds of a New Paradigm. PLoS Biol 2(5): e133

  4. Wprowadzenie do tytoniu dwóch osobnych transgenów wykorzystujących taki sam promotor Pierwszy transgen jest aktywny o ile nie jest w komórce obecny drugi transgen → metylacja DNA promotora wyciszanego transgenu w obecności drugiego zawierającego sekw. homologiczne CH3 x promotor Gen 1 • Wyciszenie i metylacja zanikają w kolejnych komórkach potomnych na skutek odseparowania dwóch transgenów • Interakcja wspólnych promotorów indukuje transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów -TGS (transcriptional gene silencing) promotor Gen 2

  5. siRNA (ang. short interfering RNA) – krótka dwuniciowa cząsteczka RNA (21-23 nt) o sekwencji homologicznej do fragmentu docelowego mRNA

  6. DICER końce 3’ mają 2nt niesparowane Uwaga: wprowadzanie dsRNA do komórek kręgowców indukuje odpowiedź interferonową

  7. DICER – enzym typu RNAza III • Zawiera domeny: • Domena o właściwościach helikazy i hydrolazy fosfodwuestrowej; • RBD (RNA Bindingdomain) – wiążąca RNA • dsRBD (dsRNABindingdomain) – wiążąca dsRNA • PAZ (Piwi, Argonaute, Zwille/Pinhead); • działa w postaci dimerycznej • → produkty działania enzymu DICER mają niesparowane 2 nukleotydy na końcu 3’ i grupę fosforanową na końcu 5’ (inne produkty słabiej indukują interferencję)

  8. RISC (RNA-inducedsilencingcomplex) jest złożony: • 1. Białka z rodziny Argonaute posiadają 3 domeny: • PAZ – wiązanie końca 3’ siRNA • Mid - wiązanie końca 5’ siRNA • PIWI – aktywność endonukleazy (pokrewna RNAzy H) • Ago1 – odpowiedzialny za represję, Ago2– za właściwości endonukleazy • do kompleksu RISC wchodzą jeszcze inne białka o nieznanej dotąd funkcji (VIG, Tudor-SN, Fragile-X, Dmp68, Gemin3) • RISC jest częścią struktury cytoplazmatycznej zwanej ciałkami P (P-bodies)

  9. Degradacja mRNA przez kompleks RISC: • w kompleksie RISC dochodzi do degradacji nici sensownej, pozostaje antysensowna (wiodąca); wybór nici jest uzależniony od stabilności termodynamicznej końców siRNA – nić posiadająca mniejszą stabilność na końcu 5’ pozostaje w RISC (etap katalizowany przez DICER) • w rejonie „seed” zlokalizowanym pomiędzy 2 i 8 nukleotydem od końca 5’ następuje rozpoznanie i wiązanie z docelowym mRNA • antysensowna nić hybrydyzuje z komplementarnym mRNA tworząc krótki fragment dwuniciowy • przecięcie mRNA w pojedynczym miejscu oddalonym pomiędzy 11-12nt od końca 3’ siRNA (Ago2) • dalsza degradacja mRNA przez niespecyficzne egzonukleazy mRNA siRNA

  10. w przypadku niepełnej komplementarności sekwencji siRNA do mRNA zachodzi inhibicja translacji • Mechanizmy odpowiedzialne za ogólną degradację mRNA: • przed degradacją zachodzi proces deadenylacji końca 3’ poli(A), po której następuje działanie egzonukleolityczne 3’ – 5’ przez egzosom • dekapowanie przez Dcp1/Dcp2, po którym degradacja przy udziale egzonukleaz 5’ - 3’

  11. Zjawisko przechodzącego wyciszania (transitive silencing) GFP siRNA białko fuzyjne UNC-22 i GFP przejście wyciszenia w kierunku od 3’ do 5’ wyciszenie UNC-22 i GFP wyciszenie GFP Gregory J. HannonRNA interference, Nature (2002) 418, 244-251

  12. Mechanizm przechodzącego wyciszania pierwotne siRNA polimeraza RNA zależna od RNA RdRP (RNA-dependent RNA polymerase) dsRNA wtórne siRNA Brodersen and Voinnet The diversity of RNA silencing pathways in plants TRENDS in Genetics (2006) 22, 268-280

  13. Metody wytwarzania siRNA: • synteza chemiczna (siRNA) • transkrypcja in vitro (esiRNA) • wektory ekspresyjne siRNA (shRNA jako pośredni etap) • ekspresyjne kasety PCR Kryteria projektowania cząsteczek siRNA: • Znajdź sekwencję 21nt która zaczyna się od AA (siRNA posiadające jednoniciowe odcinki UU działają najefektywniej); jeśli się nie da – należy wybrać sekwencję NA lub inną ale unikać jednoniciowych odcinków GG w siRNA • Zaprojektuj 2-4 sekwencje w różnych rejonach ale 50-100nt poniżej AUG (w obrębie 5’ UTR lub 3’ UTR mRNA może być związane z białkami oraz posiadać złożoną strukturę) – jedna na dwie daje 50% hamowanie a jedna na cztery – 75-95% • zawartość GC – 30-70% (optymalnie 50%) • unikać ciągu (G)3 gdyż mogą się tworzyć agregaty cząsteczek siRNA • koniec 5’ nici antysensownej ma mieć mniejszą stabliność termodynamiczną • Sprawdź komplementarność do innych genów

More Related