1 / 37

Určení rodičů (analýza paternity)

Určení rodičů (analýza paternity). Techniky. Dříve minisatelitový DNA fingerprinting alozymy, mtDNA Dnes převážně mikrosatelity Další možnosti: AFLP, SNPs, proteinový fingerprinting. mikrosatelity. Tandemová opakování krátkých motivů Např. (CTTT) n Někdy i složitější (CTTT) n (CA) n

vahe
Download Presentation

Určení rodičů (analýza paternity)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Určení rodičů(analýza paternity)

  2. Techniky • Dříveminisatelitový DNA fingerprintingalozymy, mtDNA • Dnes převážněmikrosatelity • Další možnosti:AFLP, SNPs, proteinový fingerprinting

  3. mikrosatelity • Tandemová opakování krátkých motivů • Např. (CTTT)n • Někdy i složitější (CTTT)n (CA)n • Vysoce polymorfní • Jednoduchá dědičnost • Využití: analýza paternity, identity, populační struktury… CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

  4. PCRPolymerase chain reaction(jak z málo DNA udělat hodně)

  5. primer AGGGGACGTACACTCAGCTTTtemplát TCCCCTGCATGTGAGTCGAAA primer DNAtemplátu primer tento úsek se bude množit PCR • Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá. • Co se bude množit? To určí primery. • Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu.

  6. Denaturace (obvykle 95°C)při zvýšení teploty se oddělí komplementární vlákna DNA Při ochlazení dojde k reasociaci

  7. Primery přidané v nadbytku kmitají díky Brownově pohybu Některé se dostanou do blízkosti komplementárních míst

  8. Při ochlazení primery přisednou rychleji než dojde k vzájemné reasociaci dlouhých vláken DNA(obvykle 50 - 65°C) V úseku mezi primery zůstanou vlákna DNA oddělena

  9. Primery jsou prodlužovány přidáváním nukleotidů podle sekvence templátu (obvykle 72°C – optimum pro Taq polymerázu)

  10. Při dalším zahřátí dojde k oddělení templátu a nově vzniklých vláken

  11. Po ochlazení primery přisednou na templát i nově vzniklé fragmenty

  12. Při 72°C dojde opět k prodlužování primerů a vzniku nových kopií

  13. Při dalším zahřátí…

  14. Ochlazení – nasednutí primerů 72°C vznik nových fragmentů 95°C denaturace

  15. Alely se liší délkou CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC + CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

  16. Fragmentační analýza Probíhá v sekvenátoru

  17. kapilára Elektroforéza gel

  18. kapilára Elektroforéza gel laserovýpaprsek detektor

  19. CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT primer primer GAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAA Fluorescenční značení CTTTCTTTCTTTCTTT primer primer GAAAGAAAGAAAGAAA

  20. Multiplex Více dvojic primerů v jedné reakci Různé značení Analýza se standardem standard

  21. Určení paternity Matka Otec Mládě 1 Mládě 2

  22. Určení paternity prostým vyloučením (simple exclusion)

  23. genotypy

  24. Identifikace mateřských alel u mláďat(na prvním lokusu málo alel – nebudeme se jím zabývat)

  25. Zjištěni shody otcovských alel s alelami sociálního partnera→ nalezení mimopárových mláďat

  26. Dohledání genetických otců mimopárových mláďatmládě 57

  27. Dohledání genetických otců mimopárových mláďatmládě 59

  28. Databáze na internetu

  29. DATABÁZE PROGRAMY Primární databáze DNA sekvencí GenBank (Amerika) EMBL (Evropa) DDBJ (Japonsko) BLASTNa stránkách NCBI, Ensembl BLATNa stránkách USCS Primer3 – navrhování primerů In Silico PCR RepeatMasker Databáze genů Entrez GeneRefSeq Databáze genových expresních dat UniGeneGEO Důležité odkazy NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tam najdu skoro vše: GenBank, Entrez Gene, UniGene, MapViewer, BLAST… ENSEMBL - http://www.ensembl.org/Genome Browser, BLAST USCS – http://genome.ucsc.edu/Genome Browser, BLAT, In Silico PCR Databáze genomů NCBIEnsemblUCSC Genome Browser

  30. FASTA >gi|gi-number|gb|accession|locus – description GATCCTCCATATACAACGGTATCTCCACCTCAGGTTTAGATCTCAACAACGGAACCATTGCCGACATGAGACAGTTAGGTATCGTCGAGAGTTACAAGCTAAAACGAGCAGTAGTCAGCTCTGCATCTGAAGCCGCTGAAGTTCTACTAAGGGTGGATAACATCATCCGTGCAAGACCAAGAACCGCCAATAGACAACATATGTAACATATTTAGGATATACCTCGAAAATAATAAACCGCCACACTGTCATTATTATAATTAGAAACAGAACGCAAAAATTATCCACTATATAATTCAAAGACGCGAAAAAAAAAGAACAACGCGTCATAGAACTTTTGGCAATTCGCGTCACAAATAAATTTTGGCAACTTATGTTTCCTCTTCGAGCAGTACTCGAGCCCTGTCTCAAGAATGTAATAATACCCATCGTAGGTATGGTTAAAGATAGCATCTCCACAACCTCAAAGCTCCTTGCCGAGAGTCGCCCTCCTTTGTCGAGTAATTTTCACTTTTCATATGAGAACTTATTTTCTTATTCTTTACTCTCACATCCTGTAG

  31. GenBank Obsahuje velmi podrobnou informaci o sekvenci:

  32. Sekvence v genetické bance Jsou známy nějaké sekvence mamuta? Z jakého druhu mamuta jsou známé sekvence? (nejlépe cytochrom b) NCBINational Centre for Biotechnology Informationhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/

  33. Čemu je tato sekvence podobná? • Chceme-li vyhledat sekvenci nejpodobnější k námi osekvenovanému neznámému vzorku, využijeme BLAST, opět na stránkách NCBI • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

  34. BLAST Basic Local Alignment SearchTool =========================================== Hledá lokální (částečné) podobnosti Na rozdíl od klasického alignmentu umožňuje velmi rychle a efektivně prohledávat velké databáze

  35. Úloha • Ze zbytků potravy medvěda v Pyrenejích jsem získal dvě sekvence. Čemu jsou tyto sekvence podobné? • >sekvence1 atgaccaatattcgaaaaactcacccactaataaaaattgtaaacaacgcattcattgacctcccagctccgtcaaacatctcatcatgatgaaactttggctccctcctaggcatctgc • >sekvence2 ctagccatgcactactcaccagacgcctcaaccgccttttcatcaatcgcccacatcactcgagacgtaaattatggctgaatcatccgctaccttcacgccaatggcgcctcaatattctttatctgcctcttcctacacatcgggcgaggcctatattacggatcatttctctactcagaaacctgaaacatcggcattatcctcctgcttgcaactatagcaacagcctt cataggctatgtcctcccgtgaggacaaatatcattctga • Postup: Na stránce NCBI zadám, že chci použít BLAST. Pod možnostmi Basic BLAST vyhledám nucleotide BLAST a zadám tuto možnost.Do okénka vložím sekvenci například ve FASTA formátu. V možnosti Database zadám Others. Spustím BLAST.

More Related