PROTEİNLERİN DENATÜRE JEL ELEKTROFOREZİ İLE AYRILMASI VE MOLEKÜLER AĞIRLIKLARININ TAYİNİ

1. ÇEVRE BİYOTEKNOLOJİSİ DERSİ PROTEİNLERİN DENATÜRE JEL ELEKTROFOREZİ İLE AYRILMASI VE MOLEKÜLER AĞIRLIKLARININ TAYİNİ

2. ELEKTROFOREZ • Proteinler, elektrik yükü, büyüklük, şekil gibi özelliklerine göre ayrılırlar. • Elektroforez işleminde, ortam pH’sına göre, (+) ya da (-) olarak yüklenen kolloid taneciklerin, bir elektrik alanında, kendi net yüklerine zıt yük taşıyan anot veya katoda doğru farklı hızlarda sürüklenmeleri.

3. ELEKTROFORETİKYÖNTEMLER • Karışım içinde bulunan protein sayısını tespit etmek( kağıt ve jel elektroforezi) • Saflaştırılmış proteinin saflık derecesini belirlemek ( SDS-PAGE) • Saflaştırılmış proteinin molekül ağırlığını tayin etmek (SDS-PAGE) amacıyla kullanılır.

4. SDS - PAGE • SDS:Sodyum DodesilSülfat-anyonik deterjan • (-) yüklü SDS, proteinlerin kuarterner, tersiyer ve sekonder yapılarını bozar, katları açılan peptid zincir, SDS ile sarılarak misel görünümü kazanır. • Zincirde yer alan her 2 AA artığına 1 molekül SDS bağlanır ve proteinlerin hepsi (-) yüklenir

5. POLİAKRİLAMİD JEL • Proteinlerin ayrılmasında en çok kullanılan destek matriksi olan poliakrilamid, porlu bir jel ortaya koyar. Bu jel, filtre gibi işlev görür ve küçük moleküllerin sebestçe hareketine izin verirken daha büyük makromoleküllerin geçişini kısıtlar. • Belli por büyüklüğünde bir jel hazırlayarak proteinlerin molekül büyüklüğüne göre ayırmak mümkündür.

6. Por Büyüklüğünün Belirlenmesi • Poliakrilamid jelin oluşumunda, “akrilamid” monomerleri bir çapraz bağlayıcı yardımı ile kovalent olarak bağlayan uzun zincirlere polimerize olur. Yapıyı birarada tutan esas bileşen çapraz-bağlayıcı, (cross-linker) dir. En yaygın olarak kullanılan çapraz bağlayıcı, kısaca bis adı verilen “N,N’-metilen-bis akrilamid” dir. Akrilamid jelde por büyüklüğü, akrilamid ve bis içeriğini ifade eden % T ve % Cbis terimleri ile belirlenir. % T, total akrilamid %’si (w/v), % Cbis ise bis’in monomere oranı (w/w) olup aşağıdaki formüllere göre hesaplanır. Akrilamid (g) + Bis (g) % T = x 100 Hacim (ml) Bis (g) % Cbis = x 100 Akrilamid (g) + Bis (g) • Bu formüllere göre, % 20 T ve % 5 Cbis içeren bir jelde % 20 (akrilamid +bis) ve total akrilamidin % 5’i oranında bis bulunur. % T arttıkça por çapı küçülür.

7. Elektoroforezde Kullanılan Tampon Sistemleri • Elektroforezde göç hızı proteinin net yüküne bağlı olduğundan, hızı sabit tutabilmek için, çözeltinin pH’ını sabit tutmak gerekir. Bu nedenle elektroforezde çeşitli tampon çözeltiler kullanılır. • Elektroforezde kesiksiz ve kesikli olmak üzere 2 tampon sistemi kullanılır. • Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı jel vardır, tanklarda ve jelde aynı tampon kullanılır. • Kesikli sistemde ise, farklı tamponlarda hazırlanmış iki jel kullanılır. • Seçici olmayan, büyük porlu bir jel: Yükleme jeli (stacking jel) • Daha selektif, küçük porlu bir jel: Ayırma jeli (seperating jel).

8. Stok Çözeltiler • Monomer • Tampon • % 10 SDS • H2O • TEMED • APS • Örnek uygulama tamponu • Tank tamponu • Boya çözeltisi • Fazla boyayı alma çözeltisi • Su ile doyurulmuş n-butanol çözeltisi

9. Jellerin Hazırlanması

10. Protein Örneklerinin Hazırlanması

11. Yükleme ve Elektroforez İşlemi

12. Jelin Analizi Elektroforetik ayırım bittikten sonra jel, aşağıdaki işlemlerden birisi ile analiz edilir. • Boyama (Coomassie Blue veya gümüş boyama) • Otoradyografiyi takiben densitometri • Elektroforez ile bir membrana nakletme (elektroblotting) ve daha sonra nükleik asit hibridizasyonu, otoradyografi, immunodeteksiyon gibi teknikler uygulanır.

13. Jellerin Boyanması

14. Jellerin Boyanması

15. Moleküler Ağırlığı Tayini • Molekül ağırlığı bilinmeyen protein örneği, molekül ağırlığı bilinen standart proteinlerle birlikte, aynı jel üzerinde yanyana elektroforetik olarak ayrılır. • Boyama sonrasında jelde gözlenen bantların karşılaştırılması ile proteinin molekül ağırlığı hakkında bir fikir elde edinilebilir. Ayrıca bu tip bir ayrışımın sonuçlarını matematiksel olarak değerlendirmek de olasıdır. Jeldeki göç hızının bir fonksiyonu olan relatif göç hızı (Rf değeri), jelin üst kısmından bandın bulunduğu yere kadar olan uzaklığın, jelin üst kısmından işaret boyasının olduğu yere kadar olan uzaklığa oranıdır. • Polipeptidin molekül ağırlığının logaritması ile Rf değeri arasında doğrusal ilişki vardır. Dolayısı ile standart polipeptidlerin Rf değerleri (ordinata) ve molekül ağırlığının log10 değerleri (absise) yerleştirilerek bir standart grafik hazırlanır. • Molekül ağırlığı bilinmeyen proteinin Rf değeri bulunur ve grafikte bu değere karşılık gelen noktadan aşağıya bir dik indirilerek molekül ağırlığının logaritmik değeri belirlenir. Bu değerin antilogaritması moleküler ağırlığını verir.

16. Moleküler Ağırlığı Tayini Yükleme jeli (boyama sırasında kopabilir) Ayırma jeli X x (cm) A bandı için Rf = y (cm) A Y İşaret boyasına ait bant

17. Moleküler Ağırlığı Tayini nümune Standart Molekül ağ.(log) nümune protein Sürüklenmehızı

18.  Moleküler Ağırlığı Tayini