Microscopía (2011)
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Hooke, Micrographia (1664) Mikeladze-Davi et al , Cell ( 2005) - PowerPoint PPT Presentation


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Microscopía (2011). Hooke, Micrographia (1664) Mikeladze-Davi et al , Cell ( 2005). Lic. Juan Burdisso. EVOLUCION DE LOS MICROSCOPIOS OPTICOS. Carl Zeiss 1857. STED Microscopy. http://micro.magnet.fsu.edu/. http://www.zeiss.com/micro. Tipos de Microscopia.

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Microscopía (2011)

Hooke, Micrographia(1664) Mikeladze-Davi et al, Cell (2005)

Lic. Juan Burdisso


EVOLUCION DE LOS MICROSCOPIOS OPTICOS

Carl Zeiss

1857

STED Microscopy

http://micro.magnet.fsu.edu/

http://www.zeiss.com/micro


Tipos de microscopia
Tipos de Microscopia

Microscopía de campo claro (coloreado).

Contraste de fase.

Microscopía de contraste de interferencia (DIC).

Microscopía de epifluorescencia.

Microscopía de Fuerza Atómica (AFM).

Microscopia de fluorescencia de refección interna total (TIRFM).

STED Microscopy


Partes de un Microscopio Óptico de Epifluorescencia (Nikon Eclipse 600)

http://www.microscopyu.com


Fuente Eclipse 600) : lámpara de mercurio

Célula epitelial, triple coloración:

núcleo (azul),

microtubulos (verdes),

actina (rojo). 1000X 


Entonces las partes fundamentales de un microscopio de epifluorescencia son
Entonces las partes fundamentales de un microscopio de epifluorescencia son….

* Cubos

* Objetivos

* Cámara (chip CCD) "Charge Coupled Device"

Estos componentes hacen la diferencia en este tipo de microscopia


CUBO 1 (para observar GFP; Alexa 488; etc) epifluorescencia son….

first barrier filter (Excitación) 465-495 nm (Blue light)

beam splitting mirror (Espejo Dicroico) ↑505 nm

second barrier filter (Emisión) 515-555 nm (Green light)

CUBO 2 (para observar mRFP; DsRED; Alexa 546; Alexa 546; etc)

first barrier filter (Excitación) 528-553 nm (Green light)

beam splitting mirror (Espejo Dicroico) ↑565 nm

second barrier filter (Emisión) 600-660 nm (Red light)

CUBO 3 (para observar DAPI; Hoechst;etc)

first barrier filter (Excitación) 330-380 nm (Violet light)

beam splitting mirror (Espejo Dicroico) ↑400 nm

second barrier filter (Emisión) 435-485 nm (Blue light)


RECORDEMOS: Espectros de Absorsión o Excitación y de emisión

La intensidad de fluorescencia emitida varía con la longitud (l) de excitación.

La exitación a la lmax (A), produce la fluorescencia más intensa (A).

La distribución del espectro no depende de la l de exitación.

Las moléculas fluorescentes absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten a otra longitud de onda mayor (corriemiento de Stokes).



Apertura Numérica (AN) emisión= n X sen 

n= índice de refracción

n aire: 1

n agua: 1.3

n aceite/vidrio: 1.5

Limite de Resolución = 0,61 X λ

AN

Intensidad= (Apertura Numérica)4

(Magnificación)2

Objetivos

10X NA=0.25 → R= 1.34 µm

20X NA=0.40 → R= 840 nm

40X NA=0.65 → R= 520 nm

60X NA=0.80 → R= 420 nm

100X (oil) NA=1.25 → R= 270 nm


Cámara (Chip CCD) emisión

La resolución de una cámara depende del tamaño y numero de pixeles del chip.

chip: 1360 x 1024 pixels

El Binning(reagrupación de pixeles para formar un superpixel)

B: 0

B: 2x2

B: 4x4

Que ganamos: Sensibilidad (util en muestras poco fluorescentes, para estudios in vivo).

Que perdemos: Resolución (la imagen esta mas pixelada).


Detectores electrónicos de luz (pixeles del chip CCD) emisión

Constan de una superficie fotosensible que captura los fotones incidentes

y genera cargas electrónicas que son sensadas y amplificadas.


Debe existir una relación entre la resolución de un microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Nyquist Frecuency

(Límite de resolución del microscopio → 2.3 pixeles en el chip).

Si este principio no se cumple nuestro microscopio es casi obsoleto.

función de dispersión de punto 3D

(point spread function)


El rango dinámico: microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD. parámetro relacionado con la capacidad de

captar diferencias cuantitativas entre la señal mas débil y la mas

Intensa.

2 n bits

1bit= 2 niveles de grises

2 bits= 4 niveles de grises

3 bits= 8 niveles de grises

4 bits= 16 niveles de grises

8 bits= 256 niveles de grises

9 bits= 512 niveles de grises

10 bits= 1024 niveles de grises

12 bits= 4095 niveles de grises

16 bits= 65536 niveles de grises

Fotones→ → →Electrones→ → → → → Bits

Fluorescencia → Pixeles del chip CCD → Digitización


Tipos de Microscopia microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.


Total Internal Reflection Fluorescence Microscope (TIRFM) microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

In cell and molecular biology, a large number of molecular events in cellular surfaces such as cell adhesion,

binding of cells by hormones, secretion of neurotransmitters, and membrane dynamics have been studied with

conventional fluorescence microscopes.

However, fluorophores that are bound to the specimen surface and those in the surrounding medium exist in

an equilibrium state. When these molecules are excited and detected with a conventional fluorescence microscope,

the resulting fluorescence from those fluorophores bound to the surface is often overwhelmed by the background

fluorescence due to the much larger population of non-bound molecules.

The TIRFM was developed by Daniel Axelrod at the University of Michigan, Ann Arbor in the early 1980s.

A TIRFM uses evanescent wave to selectively illuminate and excite fluorophores in a restricted region of the

specimen immediately adjacent to the glass-water interface.

The evanescent wave is generated only when the incident light is totally reflected at the glass-water interface.

The evanescent electromagnetic field decays exponentially from the interface, and thus penetrates to a depth of

only approximately 100 nm into the sample medium.

The selective visualization of the plasma membrane renders the features and events on the plasma membrane in

living cells with high axial resolution. TIRF can also be used to observe the fluorescence of a single molecule,

making it an important tool of biophysics and quantitative biology.


Total internal reflection fluorescence microscopy ( microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.TIRFM) exploits the properties of an induced evanescentwaveor fieldin a limited specimen region immediately adjacent to the interface between two media having different refractive indices.

Beyond the angle of total reflection,

the electromagnetic field of the incoming/reflected light still extends into the z direction.

This evanescentwaveis identical in frequency to the incident light, but it decays exponentially in intensity with distance from the interface and its effects extend only a few hundred nanometers into the second medium (having the lower refractive index).


Marcación: GFP-PTP 1B DA microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Epifluorescencia

TIRFM

Fotos: Lic Ana G Wusener


Microscopía Confocal microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Fuente de luz: Lasers

Detectores: Tubos fotomultiplicadores

Pinholes (confocalidad)


Microscopía Confocal microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Microscopía de Epifluorescencia


Seccionamiento óptico y recosnstrucción 3D microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Polen


STED MICROSCOPY microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

(Stimulated Emission Depletion)


Microscopia STED microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Actin Fibers

Sample Courtesy of Elise Stanley, Division of Genetics & Development,Toronto Western Research Institute (TWRI), Canada


Microscopia STED microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Keratin Filaments

YFP labeled keratin filaments in SW-13 cells.Sample: courtesy of Reiner Windoffer, RWTH Aachen University, Institute of Molecular and Cellular Anatomy, Aachen, Germany


Microscopia STED microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Clathrin Vesicles

Distribution of Clathrin vesicles in HeLa cells.Fluorescent marker: Alexa 488, immunolabeling.


Microscopía de contraste de fase microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

  • Las zonas coloreadas reducen

  • la amplitud de ondas de luz de

  • determinadas longitud que pasan

  • a traves de ellas.

B) La luz que pasa a través de una célula

experimenta poco cambio en su amplitud.

Sin embargo hay un cambio de fase al

pasar a través de la célula y estos cambios

se hacen visibles explotando los efectos

de interferencia


Microscopía en contraste de fase microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para espécimenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz. En el microscopio de fase el cono de luz entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible.


Microscopía de campo claro microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Absorción : es la disminución en la amplitud de onda cuando esta pasa a través de un objeto . La mayoría de las células muestran muy baja absorción con la luz visible. Esto resulta en la naturaleza transparente del objeto bajo la luz del microscopio, y en un contraste pobre.


Microscopía de campo claro microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD. (preparados coloreados)

  • Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera

Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados.


Microscopía de contraste de interferencia (DIC) microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Nomarski - DIC. Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseñado para observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales. DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases


Microscopía de Fuerza Atomica (AFM) microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

El Microscopio de Fuerza Atómica (MFA) es un instrumento mecano-óptico capaz de

detectar fuerzas del orden de los nanonewton. Al analizar una muestra, se registra

continuamente la altura sobre la superficie de una sonda o punta cristalina de forma

piramidal. La sonda va acoplada a un listón microscópico, muy sensible al efecto de

las fuerzas, de sólo unos 200 μm de longitud.

La fuerza atómica se puede detectar cuando la punta se aproxima a la superficie de la

muestra. Se registra la pequeña flexión del listón mediante un haz láser reflejado

en su parte posterior. Un sistema auxiliar piezoeléctrico desplaza la muestra

tridimensionalmente, mientras que la punta recorre ordenadamente la superficie.

Todos los movimientos son controlados por una computadora.

La resolución del instrumento es de menos de 1 nm, y la pantalla de visualización

permite distinguir detalles en la superficie de la muestra con una amplificación de

varios millones de veces.

El microscopio de MFA, puede realizar dos tipos de medidas: imagen y fuerza. En la

modalidad de imagen, la superficie es barrida en el plano de la superficie por la

punta. Durante el barrido la fuerza interatómica entre los átomos de la punta y los

átomos en la superficie de la muestra, provoca una flexión del listón. Esta flexión es

registrada por un sensor adecuado (normalmente balanza óptica) y la señal obtenida

se introduce en un circuito o lazo de realimentación. La fuerza interatómica se puede

detectar cuando la punta está muy próxima a la superficie de la muestra. En medidas

de fuerza la punta se hace oscilar verticalmente mientras se registra la flexión del

listón. Las medidas de fuerza son útiles en estudios de fuerzas de adhesión y permiten

estudiar a nivel de una sola molécula interacciones específicas entre moléculas (ej:

Interacción molécula de adhesión celular- proteínas de matriz extracelular, interacción

antígeno-anticuerpo, interacción entre hebras complementarias de ADN) o

interacciones estructurales de las biomoléculas (plegado de proteínas) así como

caracterizar la elasticidad de polímeros.


Microscopía de Fuerza Atomica (AFM) microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Tocadisco molecular


Microscopía de Fuerza Atomica (AFM) microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.

Moléculas de ADN


microscopio y la cantidad de pixeles del chip CCD.FIN”


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