第十三章生化药物和基因工程药物分析概念

第十三章生化药物和基因工程药物分析概念

第一节概述 生物药物（biopharmaceutics或biopharmaceuticals）是利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学等学科的原理与方法制得的天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物。生物药物主要包括生化药物（biochemical drugs）、生物技术药物（bio-technology drugs)和生物制品（biological products)等。

生化药物是从动物、植物及微生物等生物体分离纯化制得的生化基本物质，以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等，如氨基酸、多肤、蛋白质、酶、多糖、脂质、核昔酸类等。生化药物是从动物、植物及微生物等生物体分离纯化制得的生化基本物质，以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等，如氨基酸、多肤、蛋白质、酶、多糖、脂质、核昔酸类等。

生物技术是利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系，用现代生物技术研制的药物称为生物技术药物（或生物工程药物）。生物技术是利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系，用现代生物技术研制的药物称为生物技术药物（或生物工程药物）。

基因工程药物（Genetic engineering drugs）：系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。

生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。

一．生化药物和基因工程药物的定义1.生化药物2.基因工程药物一．生化药物和基因工程药物的定义1.生化药物2.基因工程药物

二、生化药物和基因工程药物的种类（一）生化药物的种类1.氨基酸、多肽与蛋白质类药物：单氨基酸、氨基酸衍生物和复合氨基酸类，消化道多肽、下丘脑多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。2.酶类与辅酶类药物：蛋白水解酶类、凝血酶及抗栓酶，辅酶Q10等。二、生化药物和基因工程药物的种类（一）生化药物的种类1.氨基酸、多肽与蛋白质类药物：单氨基酸、氨基酸衍生物和复合氨基酸类，消化道多肽、下丘脑多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。2.酶类与辅酶类药物：蛋白水解酶类、凝血酶及抗栓酶，辅酶Q10等。

3.多糖类药物:肝素、硫酸软骨素A和C;灵芝多糖、人参多糖、海藻多糖、多糖等类肝素。3.多糖类药物:肝素、硫酸软骨素A和C;灵芝多糖、人参多糖、海藻多糖、多糖等类肝素。

4.脂质类药物:多价不饱和脂肪酸（PUFA）、磷脂类、固醇类类等。5.核酸及其降解物和衍生物类药物:RNA、DNA、多聚胞昔酸、琉基聚胞昔酸、ATP和cAMP等。4.脂质类药物:多价不饱和脂肪酸（PUFA）、磷脂类、固醇类类等。5.核酸及其降解物和衍生物类药物:RNA、DNA、多聚胞昔酸、琉基聚胞昔酸、ATP和cAMP等。

（二）基因工程药物的种类 基因工程DNA重组药物主要成分为多肤或蛋白质类，大致可分为以下三大类：1.激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子（human somatotin )，人胰岛素（human insulin)，人生长激素（human growth hormone）

2.细胞因子类药物：人干扰素（human interferons），人白细胞介素（human interleukina)，集落刺激因子（colony-stimulating factors，CSF)，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）

3.酶类及凝血因子类药物：单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、内啡肽、反义药物、人生长激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等。3.酶类及凝血因子类药物：单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、内啡肽、反义药物、人生长激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等。

三、生化药物和基因工程药物的特点1.基因工程药物具有细胞和组织特异性，形成受体一配体复合物；多数细胞因子具有多功能性，具有广泛的药理活性；细胞因子间存在复杂的相互作用，临床使用有时需要几种生长因子配合使用；具有低免疫活性。许多基因工程药物是参与人体一些生理功能所必需的蛋白质，极微量产生显著的效应。三、生化药物和基因工程药物的特点1.基因工程药物具有细胞和组织特异性，形成受体一配体复合物；多数细胞因子具有多功能性，具有广泛的药理活性；细胞因子间存在复杂的相互作用，临床使用有时需要几种生长因子配合使用；具有低免疫活性。许多基因工程药物是参与人体一些生理功能所必需的蛋白质，极微量产生显著的效应。

2.分子量大 大部分为蛋白质、多肤、多糖、核酸类等大分子的化合物，有的化学结构不确定，分析时需进行纯度检查和分子量的测定。对大分子的药物而言，即使组分相同，由于分子量不同而产生不同的生理活性。3.结构确证难 4.全过程的质量控制原材料、生产过程和产品的质量控制。

5.生物活性检查生物检定法6.安全性检查 例如热原检查、过敏试验、异常毒性试验、致突变试验和生殖毒性试验等。7.效价（含量）测定通过理化分析进行含量测定，但酶类需进行效价测定或酶活力测定，以表明其有效成分的生物活性。

8.生化药物和基因工程药物生物活性质量控制特点。 生化药物和甚因工程药物生物活性质量控制对比

第二节质量检验的基本程序与方法一、鉴别试验（一）理化鉴别法1.化学鉴别法 利用药物与某些试剂在一定条件下的呈色反应、沉淀反应等，生成具有颜色的产物或沉淀进行鉴别。

2.紫外分光光度法 利用药物中的共扼系统在紫外区有特征吸收用于鉴别。蛋白或多肽分子的最大吸收波长是固定的。

3.高效液相色谱法 利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。凡有紫外吸收的物质均能在图谱上显示出来，一般要求纯度要达95%以上。肽图分析、氨基酸成分和序列分析合并研究，可作为蛋白质等天然产品精密比较的手段。

（二）生化鉴别法酶法 、电泳法、样品脱盐后用等电点聚焦法测定（三）生物鉴别法利用生物体进行试验来鉴别药物，家兔惊厥试验

二、杂质检查（一）一般杂质检查（二）特殊杂质检查1.原料药的纯度分析 多糖类，酶类药物纯度分析2.生产过程中杂质的检查基因工程药物的生产过程更为复杂，质量须全面控制。

三、安全性检查（一）热原检查法和细菌内毒素检查法（二）异常毒性试验 异常毒性试验是用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反应。反应的判断以试验动物死亡与否为终点。是限度试验

（三）过敏试验 过敏试验是检查异性蛋白的试验。（四）降压物质试验降压物质试验是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其它导致血压降低的物质。中国药典采用猫（或狗）血压法检查药物中所含有的降压物质。

（五）无菌试验 无菌试验是检查药品及敷料是否染有活菌的一种方法。

（六）基因工程药物中可能杂质与污染物检查 基因工程药物中可能的杂质有残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素、蛋白质突变体和蛋白质裂解物等。主要污染物有微生物、热原和病毒等。主要检查项目有外源性DNA、宿主细胞蛋白质、其它有关杂质和细菌内毒素检查。（七）致突变试验（八）生殖毒性试验

四、含量（效价）测定 生化药物和基因工程药物的含量表示方法通常有两种，一种用百分含量表示，适用于结构明确的小分子药物或经水解后变成小分子的药物。另一种用生物效价或酶活力单位表示，适用于酶类和蛋白质类等药物的测定。（一）含量测定：HPLC法、十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）

（二）效价测定 效价测定均采用国际或国家参考品，或经过国家检定机构认可的参考品，以体内或体外法（细胞法）测定其生物学活性，并标明其活性单位。一般用免疫学方法测定的效价不能代替生物学效价，只能作为中间品的质量控制。在测定效价的同时，应测定蛋白质含量，计算出特异比活性，活性以单位数／毫克蛋白（IU/mg）表示。

第三节常用定量分析方法及其应用一、理化分析法 包括化学分析法（重量法、滴定分析法）、电化学分析法、光谱分析法（比色法、紫外分光光度法、荧光分光光度法）和色谱法（高效液相色谱法、灌注色谱法和高效毛细管电泳法）等。

（一）化学分析法1.重量法根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量。根据被测组分分离方法的不同，可分为提取法、挥发法和沉淀法等。2.滴定分析法（二）电化学分析法（三）光谱分析法比色法、紫外分光光度法、荧光分光光度法

（四）色谱分析法1.高效液相色谱法（HPLC）具有在分离过程中不破坏样品的特点，特别适合于对高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的生化药物的分析。（1）反相高效液相色谱法（RP-HPLC）固定相：C8、C18烷基硅烷键合相流动相：甲醇、水或乙腈，紫外、荧光检测器。

(2)高效离子交换色谱法（HPIEC )具有以下特点：1)根据相应的离子化程度对蛋白质、多肽进行分离2)盐浓度梯度洗脱法3)柱效中等并具有较高质量的活性回收

（3）高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）HPGFC可用于多肽和蛋白质等生物药物的分离及其分子量的测定。（3）高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）HPGFC可用于多肽和蛋白质等生物药物的分离及其分子量的测定。

HPGFC具有如下特点：1)活性蛋白质可以回收2)在固定比例的水溶液中进行的分离3)是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有效粒径而进行的分离。当蛋白质具有相同形状（如球状或纤维状）时，通常可以根据分子量来预示组分的洗脱顺序，故可用来测定蛋白类药物的分子量。HPGFC具有如下特点：1)活性蛋白质可以回收2)在固定比例的水溶液中进行的分离3)是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有效粒径而进行的分离。当蛋白质具有相同形状（如球状或纤维状）时，通常可以根据分子量来预示组分的洗脱顺序，故可用来测定蛋白类药物的分子量。

2.灌注色谱法1.基本理论2.灌注色谱法主要用于基因工程药物和其它大分子药物的分离纯化和分析。3.高效毛细管电泳法（HPCE） 毛细管电泳法是根据带电组分在管中由于其所带电荷和分子量的大小，即荷质比不同产生不同的迁移速度而进行分离。

二、酶法 酶法包括两种类型：“酶活力测定法”；“酶分析法”。二者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是以酶能专一而高效地催化案些化学反应为基础，通过对酶反应速度的测定或生成物等浓度的测定而检测相应物质的含量。

（一）酶活力测定法1.基本概念 所谓酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示，酶反应速度越快所表示的酶活力越高。

国际理论化学和应用化学协会（IUPAC）和国际生物化学协会（IBU）推荐的 酶单位定义：任何一种酶，系指在25℃以最适当的底物浓度、最适当的缓冲液离子强度以及最适当的pH等条件下，每分钟能转化一微摩尔底物的酶量定为一个活性单位（国际单位，IU）。

酶活力测定可采用物理法、化学法或酶分析法等。常用的方法有终点法、动力学法或反应速率法。酶活力测定可采用物理法、化学法或酶分析法等。常用的方法有终点法、动力学法或反应速率法。

2.酶促反应的条件及影响因素 选择反应条件的基本要求是所有待测定的酶分子都应该正常地发挥其作用。确定反应条件时应考虑底物浓度、pH、温度、辅助因子、空白和对照试验等因素，使其都处于最适于酶发挥催化作用的水平。

3.测定方法 测定方法有取样测定和连续测定法。检测方法：常用的有紫外一可见分光光度法和荧光分光光度法、旋光度法、酶偶联测定法。

（二）酶分析法 分析对象是酶的底物、辅酶活化剂、酶的抑制剂。1.动力学分析法2.总变量分析法本法又称为平衡法或终点法。仅适用于底物的测定。

三、电泳法 （一）电泳法的基本原理和分类在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下于以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。电泳分离是基于溶质在电场中的迁移速度不同而进行的分析方法几，根据电泳的分离特点，电泳法可分为三大类：自由界面电泳、区带电泳、高效毛细管电泳（HPCE)。

（二）常用电泳法的类型及其应用 纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、PAGE法、SDS-PAGE法、琼脂糖凝胶电泳法

四、生物检定法 生物检定法是利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。以药物的药理作用为基础、生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试品和相应的标准品或对照品在一定条件下比较产生特定生物反应的剂量比例，来测得供试品的效价。

生物检定法的应用范围如下：1.药物的效价测定2.大分子结构的测定3.微量生理活性物质的测定生物检定法的应用范围如下：1.药物的效价测定2.大分子结构的测定3.微量生理活性物质的测定

第十三章 生化药物和基因工程药物分析概念